Основные методы исследования клеточной физиологии ЦНС.

Методы регистрации электрических сигналов нервных клеток включают использование внеклеточных и внутриклеточных электродов. Внеклеточные электроды - металлические иглы, стеклянные капилляры и электроды-присоски для регистрации токов одиночных ионных каналов (метод «пэтч-кламп»). Внутриклеточные электроды - стеклянные микропипетки, заполненные раствором электролита (главным образом соли калия). Для регистрации токов возбудимой мембраны применяют метод фиксации на ней напряжения (рис. 1). В любой схеме опыта электрод через усилитель соединяется с осциллографом и самописцем для регистрации изучаемых процессов. Дополнительно исследуемый сигнал записывают в память компьютера для последующей обработки. Кроме регистрации стеклянные микроэлектроды применяют для вне- и внутриклеточного подведения (в том числе и ионофоретическим путем) различных веществ. Через внутриклеточный микроэлектрод клетка может быть заполнена красителем, что позволяет сопоставить электрофизиологические и морфологические характеристики нейрона.

Рис. 1. Регистрация электрических токов мембраны нейронов методом фиксации напряжения (А) и токов одиночных ионных каналов с помощью электрода-присоски («пэтч-кламп» метод) (Б)[3]:

А. Фиксация напряжения двумя внутриклеточными электродами. Дифференциальный усилитель (4) производит сравнение МП (E_m) с заданным потенциалом фиксации (5) и управляет внутриклеточно инъецируемым током (I_m) по механизму отрицательной обратной связи. Измеряемый ток компенсации разности сравниваемых потенциалов эквивалентен трансмембранному ионному току, вызванному смещением МП. Технически метод может быть осуществлен также с помощью одного микроэлектрода. Б. Выходное напряжение (6) усилителя (4) удерживает потенциал электрода-присоски (7) на нулевом относительно электрода сравнения (8) значении. Это напряжение равно создаваемой током ионных каналов разности потенциалов на сопротивлении измеряющего электрода (9). Может быть также установлено отличное от нуля (так же как на рис. А) значение напряжения фиксации на электроде сравнения (8).

1 - внеклеточное пространство, 2 - клетка, 3 - измеритель тока, 4 - дифференциальный усилитель, 5 - потенциал фиксации.

Многие исследования физиологии нервных клеток были выполнены на модельных объектах, в частности беспозвоночных (моллюски, насекомые, ракообразные). Их нервная система обладает несомненными привлекательными для экспериментатора преимуществами: состоит из небольшого сравнительно с позвоночными животными числа нейронов, тела которых расположены на поверхности нервных узлов; некоторые клетки имеют очень крупные размеры (200 - 500 мкм) и легко идентифицируемы. Все это значительно облегчает изучение физиологии отдельных нейронов с одной стороны и расшифровку клеточного механизма нервного контроля отдельных эффекторных реакций - с другой. Как оказывается, фундаментальные механизмы процессов генерации и распространения возбуждения оказываются сходными у животных различного уровня филогенетического развития. Так, например, первое полное описание ионных токов возбуждения было выполнено для мембраны гигантского аксона кальмара (А.Ходжкин и А.Хаксли), механизмы возбуждения соматической мембраны и интегративных свойств нервных клеток во многом исследованы на нейронах брюхоногих моллюсков (А.Арванитаки и Н.Халазонитис), механизмы синаптической передачи - на нервно-мышечном соединении лягушки (Б.Катц).