Занятие № 17

ТЕМА: БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ. МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Цель занятия: 1.Знать основные белки плазмы крови, их функции и особенности структуры.

2.Ознакомиться с методами разделения белков.

Исходный уровень знаний:

- структура и биологическая роль белков;

- классификация белков;

- различие альбуминов и глобулинов;

- энзимодиагностика.

Содержание занятия.

I.2. Физиологическая роль белков плазмы крови.

Характеристика отдельных белков. Понятие о нормо-, гипо- и гиперпротеинемии.

Диспротеинемии, парапротеинемии, дефектопротеинемии.

Эмбриоспецифические белки.

II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА

БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода.

Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди (сульфата меди) в щелочной среде (биуретовый комплекс). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

Порядок выполнения работы:

Осторожно перемешать, оставить на 30 минут в штативе при комнатной температуре.

Фотоколориметрировать при зеленом светофильтре 540 нм против контрольного раствора. Определив экстинкцию исследуемого раствора, найти по графику, какой концентрации белка (в г/л) она соответствует.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л (6,5-8,5 г%), у детей до 6 лет - 56-85 г/л (5,6-8,5г%).

Повышение содержания белка (гиперпротеинемия) наблюдается при ревматизме и миеломной болезни (плазмоцитоме) - до 120-150 г/л. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах, несахарном диабете, холере, тяжелых ожогах.

Понижение уровня белка (гипопротеинемия) имеет место при нефритах, злокачественных опухолях, алиментарной дистрофии.

Работа № 2. ТИМОЛОВАЯ ПРОБА.

Принцип метода.

Патологически повышенные b-глобулины, g-глобулины и липопротеиды осаждаются из сыворотки крови насыщенным тимолом. Измеряют интенсивность помутнения, зависящую от содержания белковых фракций и их количественных соотношений.

Порядок выполнения работы

Перемешать и выдержать точно 30 минут при комнатной температуре, после этого вновь перемешать и измерить оптическую плотность пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при длине волн 650 нм (светофильтр № 4).

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

Нормальные величины: 0-4 единиц S-H (единицы помутнения по Shank-Hoagland). Повышение тимоловой пробы наиболее характерно для заболеваний печени (ещё до появления желтухи). Патологические величины - более 5 единиц S-H.

Работа № 3. ПРОБА ВЕЛЬТМАНА

Принцип метода.

При добавлении к сыворотке раствора хлорида кальция и нагревании происходит нарушение коллоидальной устойчивости сыворотки.

Порядок выполнения работы.

К 0,1 мл сыворотки прибавить 4,9 мл воды, перемешать, опрокидывая пробирку, и прибавить 0,1 мл 0,5% раствора хлорида кальция. Встряхивать и нагревать пробирку над пламенем до однократного закипания смеси. Охладить пробирку и осмотреть на свету. Если хлопьев нет, то в эту же пробирку добавить еще 0,1 мл хлорида кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторить, пока не выпадут хлопья.

Результаты оценить, подсчитав общее количество пошедшего на реакцию хлорида кальция.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

В норме коагуляция наступает при прибавлении 0,4-0,5 мл раствора хлорида кальция. Проба Вельтмана снижена при паренхиматозном поражении печени и малярии. Коагуляция при добавлении большего количества раствора хлорида кальция наблюдается при ревматизме, туберкулезе легких.

Все последующие работы демонстрируются преподавателем.

Работа № 4. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

В АГАРЕ ПО ОУХТЕРЛОНИ

Принцип метода.

Рис. 4. Полуколичественный учет результатов анализа. 1- антисыворотка, 2 -тест-антиген, 3-10 - последовательное разведение исследуемой пробы: 1/1, 1/2, 1/4, и т.д. до 1/128.

Работа № 5. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ, В АГАРОВОМ И В

ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЯХ

Принцип метода.

Молекулы белков обладают свободным электрическим зарядом, величина которого и знак зависят от соотношения основных и кислых ионизированных групп в молекуле. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы белка передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Разделение смеси белков на отдельные фракции происходит в результате различия относительной молекулярной массы и зарядов молекул белков, которые перемещаются в электрическом поле неодинаково. Скорость передвижения белковых молекул пропорциональна величине их свободного заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации. Электрофоретическое разделение белков широко используется как для диагностики заболеваний, так и для препаративных целей.

Рис. 5а. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электрофореграмм.

Нормальная сыворотка (А) и сыворотки больных с множественной миеломой (Б), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г).

Рис.5б. Разделение белков сыворотки крови в полиакриламидном

геле с линейным градиентом концентраций в пределах 4-30%.

Работа № 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Принцип метода.

Иммуноэлектрофорез впервые был предложен Грабарем и Уильямсом в 1953 году и представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с последующей иммунопреципитацией в геле, что значительно повышает чувствительность метода. С помощью иммуноэлектрофореза можно провести анализ антигенной смеси, качественное и количественное определение известного антигена. Так, например, в сыворотке крови здорового взрослого человека данным методом можно выделить более 30 различных белковых фракций. В зависимости от поставленных целей можно использовать различные варианты иммуноэлектрофореза.