Электрофорез белков
При наличии заряда белки перемещаются в электрическом поле. Смеси белков можно разделять методом электрофореза – направленного движения белков от одного электрода к другому под действием постоянного электрического тока. Скорость движения зависит от массы белка и величины его заряда.
Метод электрофореза широко применяется в медицине, биохимии, биологии для изучения ферментов, тканевых и плазменных белков , при изготовлении лекарственных препаратов белковой природы.
8.4.2. Денатурация белка
Макроструктура белка является весьма чуткой к изменению условий среды, в которой существует белок.
В белковой молекуле существует постоянное равновесие между силами, формирующими третичную( четвертичную) и силами отталкивания. которые возникают внутри самой молекулы и при взаимодействии с окружающей средой. При нарушении этого равновесия изменяются четвертичная, третичная и даже вторичная структура( кроме первичной! ).
Возникает потеря природных свойств белка- денатурация.
Денатурация может быть обратимой и необратимой.
Часто видимым следствием денатурации белка является осаждение белка из раствора.
Общими факторами денатурации являются :
а) изменение температуры. Повышение температуры приводит к необратимой денатурации, большинство белков организма человека теряют свою активность при температуре выше 500С, а белки крови- даже при 43 – 450С. На этом основаны стерилизация медицинских препаратов и пастеризация пищевых продуктов.
При снижении температуры денатурация является обратимой.
Биологический белковый материал можно сохранять долго при низких температурах
( кровь, образцы тканей, растворы белковых гормонов , защитных γ-глобулинов,
стволовые клетки)
б) изменение рН среды. При изменении рН среды изменяется характер ионизации кислотных и основных групп в радикалах, изменяется характер ионного взаимодействия и количество водородных связей - изменяется пространственное строение белка и организация его активных участков. В организме человека поддерживается кислотно-основный гомеостаз. Значение рН крови равное 7,4 обеспечивает необходимую организму биологическую активность всех белковых молекул.
в) действие окислителей и восстановителей. Изменяется соотношение восстановленных тиольных групп и дисульфидных связей, что вызывает изменение третичной структуры белка. Свободные тиольные группы белков содержатся и в активных участках ферментов, участвуют в химических реакциях( образование тиополуацеталей происходит в процессе окисления биоактивных альдегидов в карбоновые кислоты . См тему «Механизмы реакций. Реакции нуклеофильного присоединения»)
Лекарственные препараты, обладающие свойствами восстановителей. используются в медицине для поддержания структуры белка( аскорбиновая кислота- витамин С, раствор тиосульфата натрия ). Для химической завивки используют препараты, создающие дополнительные дисульфидные связи ; волосы после фиксации на круглой палочке( бигуди) становятся кудрявыми.
г) ионы тяжелых металлов( свинца, меди, ртути , цинка ), которые образуют соли с тиольными группами на поверхности белковой молекулы. Попадание в желудочно-кишечный тракт солей тяжелых металлов и затем всасывание их в кровь вызывает тяжелые последствия. Различают хроническое воздействие и острое отравление. Заболевание « сатурнизм», связанное с накоплением ионов свинца в организме человека, сопровождается тяжелыми патологическими изменениями со стороны центральной нервной и кровеносной системы. Отравление ионами ртути сопровождается ранним старением организма, и приводит быстро к смерти ( в древние времена было характерно для иконописцев, которые использовали красную краску киноварь HgS, а для тонкого точного мазка обязательно брали кисточку в рот, чтобы получился острый кончик кисти).
В связи с аналогичным токсическим действие свинца запрещено этилирование бензина.
д) присутствие различных поверхностно-активных веществ, детергентов, которые влияют на гидрофобное взаимодействие в молекуле белка. Гидролиз фосфолипидов в составе мембраны сопровождается образованием солей высших карбоновых кислот- поверхностно-активных веществ, и это вызывает потерю эластических свойств мембраны ( изменение «текучести» мембраны).
е) действие веществ, которые конкурируют за образование водородных связей, например, мочевины. Высокое и низкое содержание мочевины в крови способствует изменению свойств белков крови и внутриклеточных белков, особенно в составе белков мембран нейронов.
ж) действие электролитов, которые разрушают гидратную оболочку белка( процесс «высаливания»). На этом основаны рекомендации полоскать горло солевыми растворами во время заболевания и в профилактических целях. Уже в древние времена знали, что засыпание солью( сильнейшая боль ! ) огнестрельной или резаной раны в условиях боя предотвращает развитие гангрены.
з) физические воздействия ( ультразвук, лазерное воздействие, электрокоагуляция. ). Используется в медицинских целях в косметологии, лечении кожных, стоматологических болезней, в хирургии для остановки кровотечения. В современных медицинских технологиях используют лазерный луч.
8.5.Качественные реакции обнаружения белков в биологических объектах.
Биуретовая реакция – обнаруживает пептидные связи. При добавлении иона Си(+2) в щелочной среде сопровождается развитием цветной фиолетовой окраски. Интенсивность окраски пропорциональна количеству пептидных связей( содержанию белка в биологической жидкости). В биохимической лабораторной диагностике на основе биуретовой реакции используют методики Фолина или Лоури.
Ксантопротеиновая реакция- при действии азотной кислоты и последующем нагревании смеси получается осадок желтого цвета. Обнаруживает ароматические аминокислоты в составе белка ( фенилаланин и тирозин)
Подробно методики приведены в «Практикуме по биоорганической химии»
авторы Каминская Л.А., Перевалов С.Г.
8. 6. Приложение. История развития химии белков
Термин белковый ( albumineise) был впервые применен французским химиком Ф. Кене в 1747 г. Так стали называть все биологические жидкости организма по аналогии с яичным белком. «Энциклопедия» Д. Дидро и Ж. Д' Аламбера в 1751 году именно так объясняла этот термин. В дальнейшем начались систематические исследования белков.В 1759г. А.Кессель-Майер выделил клейковину из растений, в 1762г. А. Халлер изучал процесс образования и свертывания казеина молока, в 1777г. А. Тувенеель, работавший в С-Петербурге, назвал творог белковой частью молока. В тот же период французский химик А. Фуркруа доказал единую химическую природу белков растительного и животного происхождения.
В 1803 г. физик и химик Дж. Дальтон( ему принадлежит формулировка закона кратных отношений, исследование газовых законов и описание дефекта цветового зрения) отнес белки к азотсодержащим соединениям. В 1810г. известный всем школьникам Ж. Гей-Люссак провел химический анализ фибрина крови. Предполагают, что первым провел гидролиз белков А. Браконно в 1820 г. и получил аминокислоты, в том числе глицин и лейцин.
Первая теория строения белков принадлежит химику Г. Мульдеру, он сформулировал ее в 1836г.Он предположил, что существует минимальная структурная единица, из которой простроены все белки , состав ( 2 С8 Н12 N2 + S0) и назвал ее протеином.
Позднее теория была опровергнута, но термин остался и прочно вошел не только в научный язык химиков.
В 1882г. В.Даль в «Толковом словаре русского языка» объясняет слово протеин- вещество, найденное в животных тканях.
В книге Д.И.Меделева( 2-е изд. СанктПетербург, Изд. Товарищества «Общественная польза» 1863г.), упоминаются термины белки и протеиновые вещества :
« Из органическихъ веществъ общи всемъ организмамъ протеновыи или белковыя вещества, отличающиеся сложным составомъ, способностью легко изменяться и даже способствовать измененiю других веществъ. Белковое вещество, производящее эти изменения, называется ферментомъ»( сохранено правописание).
Близок к открытию структуры белка был российский биохимик А.В. Данилевский
( 1838 – 1923), который много занимался изучением ферментов и проблемой питания.
В 1902 г. работы Т. Курциуса по синтезу пептидов привели к созданию пептидной гипотезы : « все белки состоят из аминокислот, соединенных между собой связью
–СО-NH»
Окончательно «пептидную теорию» сформулировали Э.Фишер и В. Гофмейстер( Нобелевская премия Э. Фишера 1902 г.)
ь Успешное изучение состава белков началось благодаря работам английского биохимика Ф.Сэнгера, который в 1945 разработал метод определения аминокислотной последовательности( лауреат Нобелевских премий 1958, 1980) и С. Мура, который сконструировал в 1958 г. автоматический аминокислотный анализатор.( Нобелевская премия 1972)
Строение пептидной группы стало возможным изучить после открытия метода рентгеноструктурного анализа.
Теорию строения а- спирали - и термин »вторичная структура» белка создал Л.Полинг ( 1951г. совместно с Р. Кори). Л. Полинг- лауреат Нобелевских премий ( по химии 1954, мира 1962).
Структура « складчатый» лист исторически была открыта раньше , У. Астбери в
1941 г. при рентгеноструктурных исследованиях белка кератина
Термин « четвертичная» структура был введен в 1958 г. английским кристаллографом Дж. Берналом в дополнение к принятым понятиям первичной, вторичной, и третичной структуры, а в 1965г. Ж. Моно ввел понятие «протомер» для названия наименьшей структурной единицы сложной белковой молекулы( чаще теперь называют «субъединица»)
Метод рентгеноструктурного анализа долгое время оставался самым точным для расшифровки пространственного строения белка: в 1936г Дороти Ходжкин исследовала и предложила пространственную структуру инсулина, в 1960 –Д.К.Кендрью – пространственное строение миоглобина. Сейчас используются компьютерное моделирование и приборные методы исследования: методы ЯМР
( ядерного магнитного резонанса) , ПМР протонного магнитного резонанса).
Для проверки усвоения темы рекомендуем ответить на вопросы:
1. Анализ дипептида показал, что он состоит из двух различных аминокислот : глицина и аланина. Сколько различных дипептидов можно составить?
2. Трипептид состоит из двух аминокислот: глицина и аланина. Запишите все возможные варианты строения этого трипептида.
3. Последовательность аминокислот в трипептиде: ала – глу - вал. Определите среду его водного раствора и заряд пептида в растворе.
4. Последовательность аминокислот в пептиде гли – лиз – сер. Этот пептид находится в растворе кислоты, рН= 3, 5. Определите величину заряда пептида.
5. Пептид состава асп – арг – фен находится в растворе в изоэлектрической точке.
Составьте формулу трипептида и определите область значения изоэлектрической точки ( кислая, нейтральная, щелочная). Какую надо создать среду, чтобы этот трипептид при электрофорезе двигался к катоду ?
6.Трипептид глутатион - антиоксидант крови и тканей – состоит из последовательно соединенных аминокислот : γ –глутамат- цистеин –аланин. Запишите формулу соединения и реакцию окисления этого соединения пероксидом водорода . .
Дата добавления: 2015-08-11; просмотров: 2136;