Дополнительный материал к занятию. Методы культивирования вирусов

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов используют следующие методы:

1) заражение животных (внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, интраназально, заражение в мозг и другие);

2) на куриных эмбрионах после заражения их на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в амниотическую полость, в желточный мешок;

3) на культуре клеток различных тканей.

Культура ткани - это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определённым вирусам. Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются клетки с быстрым ростом и высоким уровнем обмена веществ. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др.), а также культуры тканей опухолей. Выращивание клеток культур тканей производят в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля и др.) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, пластинки стекла, стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда или пластинку стекла в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста другой микрофлоры (кроме вирусов) вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Размножение вируса в клетках определяют по цитопатическому действию (ЦПД): в результате размножения вируса в клетках при микроскопии обнаруживаются включения, дегенеративные изменения и в конечном итоге клетки гибнут. Так как рост клеток прекращается, рН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса). В связи с этим не изменяется и цвет среды. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкостей организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие). В настоящее время в вирусологической практике чаще всего применяют свежие культуры клеток (первичные или первично-трипсинизированные) и перевиваемые культуры (линии) клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из органов взрослых животных (чаще из почек обезьян и других животных) и эмбрионов человека, куриных фибробластов путём трипсинизации кусочков тканей с последующим культивированием клеток в питательной среде. С этой целью кусочки тканей измельчают ножницами (или другим способом), а затем промывают буферным раствором Хенкса для удаления клеток крови и обрабатывают 0,25-0,3% раствором трипсина. Трипсин разрушает межклеточные мостики и разъединяет клетки. С помощью камеры Горяева подсчитывают количество клеток, разводят до концентрации 400000 клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток разливают в пробирки, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37⁰С в почти горизонтальном положении (под углом 5⁰) в специальных штативах. Через 3-4 дня на стенке пробирки образуется сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

Перевиваемые культуры клеток (растущие) – это стабильные линии клеток, пассируемые вне организма в течение многих лет. Их получают из злокачественных опухолей и из нормальных (эмбриональных) тканей человека и животных. К ним относятся: 1) линия Неlа - клетки карциномы шейки матки человека; 2) линия Нер-2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) линия Детройт-6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком лёгких; 4) линии А-0 и А-1 – клетки амниона человека; 5) линия СОЦ – клетки сердца обезьяны циномольгус и другие.

Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток – это клетки тканей человека, сохраняющие в процессе пассажей - до года - диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Методы обнаружения вирусов в культуре ткани

Цитопатическое действие (ЦПД).

Реакция гемадсорбции.

Метод «цветных» проб.

Метод бляшек.

Иммунофлюоресцентный метод.

Реакция связывания комплемента.

Реакция гемагглютинации.

Реакция преципитации в агаре.

Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.