Аэробная фаза дыхания

Вторая фаза дыхания — аэробная—локализована в митохондриях и требует при­сутствия кислорода. В аэробную фазу дыхания вступает пировиноградная ки­слота. Общее уравнение этого процесса следующее:

2ПВК + 5О₂ + 6Н₂О → 6СО₂ + 5Н₂О.

Процесс можно разделить на три основные стадии: 1) окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты; 2) цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса); 3) заключительная стадия окисления — электронтранспортная цепь (ЭТЦ) требует обязательного присутствия О₂. Первые две стадии происхо­дят в матриксе митохондрий, электронтранспортная цепь локализована на внут­ренней мембране митохондрий.

Первая стадия — окислительное декарбоксилирование пировиноградной кисло­ты.Общая формула данного процесса следующая:

CH₃COCOOH + НАД + КоА - SH → CH₃CO-S- КоА + НАДН + Н⁺ + СО₂.

Процесс этот состоит из ряда реакций и катализируется сложной мультифер-ментной системой пируватдекарбоксилазой. Пируватдекарбоксилаза включает в себя три фермента и пять коферментов (тиаминпирофосфат, липоевая кисло­та, коэнзим А — KoA-SH, ФАД и НАД). Вся эта система имеет молекулярную массу 4,0-10⁶. В результате этого процесса образуется активный ацетат — ацетилкоэнзим А (ацетил-КоА), восстановленный НАД (НАДН + Н⁺), и выделяет­ся углекислый газ (первая молекула). Восстановленный НАД поступает в цепь переноса электронов, а ацетил-КоА вступает в цикл трикарбоновых кислот. Важ­но отметить, что пируватдегидрогеназная система ингибируется АТФ. При накоплении АТФ выше определенного уровня превращение пировиноградной кислоты подавляется. Это один из способов регуляции интенсивности протека­ния аэробной фазы.

Вторая стадия — цикл трикарбоновых кислот(цикл Кребса). В 1935 г. венгер­ский ученый А. Сент-Дьердьи установил, что добавление небольших количеств органических кислот (фумаровой, яблочной или янтарной) усиливает поглоще­ние кислорода измельченными тканями. Продолжая эти исследования, Г. Кребс пришел к выводу, что главным путем окисления углеводов являются цикличе­ские реакции, в которых происходит постепенное преобразование ряда орга­нических кислот. Эти преобразования и были названы циклом трикарбоновых кислот или циклом Кребса. Сам исследователь за эти работы в 1953 г. был удо­стоен Нобелевской премии.

В цикл вступает активный ацетат, или ацетил-КоА. Сущность реакций, входящих в цикл, состоит в том, что ацетил-КоА конденсируется с щавелевоуксусной кислотой (ЩУК). Далее превращение идет через ряд ди- и трикарбоновых органических кислот. В ре­зультате ЩУК регенерирует в прежнем виде. В процессе цикла присоединяются три молекулы Н₂О, выделяются две молекулы СО₂ и четыре пары водорода, ко­торые восстанавливают соответствующие коферменты (ФАД и НАД). Суммар­ная реакция цикла выражена уравнением:

CH₃CO-S-KoA + 3Н₂О + 3НАД + ФАД + АДФ + Ф_н →
2СО₂ + SH-KoA + 3НАДН + 3Н⁺ + ФАДН₂ + АТФ

Отдельные реакции протекают следующим образом. Ацетил-КоА, конден­сируясь с ЩУК, дает лимонную кислоту, при этом КоА выделяется в прежнем виде. Этот процесс катализируется ферментом цитратсинтазой. Лимонная ки­слота превращается в изолимонную. На следующем этапе происходит окисле­ние изолимонной кислоты, реакция катализируется ферментом изоцитратде-гидрогеназой. При этом протоны и электроны переносятся на НАД (образуется НАДН + Н⁺). Для протекания этой реакции требуются ионы магния или мар­ганца. Одновременно происходит процесс декарбоксилирования. За счет одного из атомов углерода, вступившего в цикл Кребса, первая молекула СО₂ выделя­ется. Образовавшаяся сс-кетоглутаровая кислота подвергается окислительному декарбоксилированию подобно тому, которое разбиралось по отношению к пи-ровиноградной кислоте. Этот процесс также катализируется мультиферментным комплексом кетоглутаратдегидрогеназой, содержащим тиаминпирофосфат, липоевую кислоту, коэнзим А, ФАД и НАД. В результате за счет второго атома углерода, вступившего в цикл, выделяется вторая молекула СО₂. Одновременно происходит восстановление еще одной молекулы НАД до НАДН и образуется сукцинил-КоА. На следующем этапе сукцинил-КоА расщепляется на янтарную кислоту (сукцинат) и HS—КоА. Выделяющаяся при этом энергия накапливает­ся в макроэргической фосфатной связи АТФ. Такой этап важен, так как выделяю­щаяся энергия непосредственно накапливается в АТФ. Этот тип образования АТФ, подобно ее образованию в процессе гликолиза, относится к субстратному фосфорилированию. Образовавшаяся янтарная кислота окисляется до фумаро-вой кислоты. Реакция катализируется ферментом сукцинатдегидрогеназой, про-стетической группой которого является ФАД. Одновременно выделяется третья пара водородов, образуя ФАД-Н₂.

На следующем этапе фумаровая кислота, присоединяя молекулу воды, превращается в яблочную кислоту с помощью фермента фумаратдегидрогеназы. На последнем этапе цикла яблочная кислота окисляется до ЩУК. Эту реакцию катализирует фермстмалатдегидрогенеза, активной группой которого является НАД, и происходит выделение четвертой пары протонов — образуется НАДН + Н⁺. Таким образом, ЩУК регенерирует в прежнем виде и может реагировать со следующей молекулой активного ацетата, поэтому практически ЩУК в про­цессе цикла не расходуется. Одновременно в ходе каждого цикла выделяются две молекулы СО₂ и образуются три молекулы НАДН + Н⁺ и молекула ФАДН₂.

Многие реакции цикла Кребса обратимы. Важно также отметить, что обра­зовавшиеся в рассмотренных реакциях органические кислоты могут служить ма­териалом для построения аминокислот, жиров и углеводов. В этом случае они выводятся из цикла. Вместе с тем соединения, входящие в цикл, могут образо­вываться в ряде других реакций (например, при декарбоксилировании амино­кислот) и вступать в цикл. Таким образом, рассмотренные превращения не от­делены от других реакций метаболизма, а тесно с ними взаимосвязаны.

Для реакций цикла Кребса кислород не требуется. Кислород необходим для регенерации или окисления восстановленных коферментов (НАДН + Н⁺ и ФАД-Н₂). Количество окисленных форм этих коферментов ограничено. В ана­эробных условиях, когда регенерация коферментов невозможна, они быстро оказываются исчерпанными и весь процесс прекращается. Окисление кофер­ментов осуществляется в дыхательной цепи, или цепи переноса водорода и элект­ронов. Конечным акцептором в этой цепи является кислород воздуха. Энергия, высвобождаемая при окислении коферментов, накапливается в макроэргиче-ских фосфатных связях АТФ.

Подводя итог, можно отметить, что в результате распада 1 молекулы ПВК в аэробной фазе (декарбоксилирование ПВК + цикл Кребса) выделяется 3СО₂, 4 молекулы НАДН + Н⁺ и 1 молекула ФАДН₂. Таким образом, 5 пар Н₂, обра­зующихся из ПВК и воды, поступают в дыхательную цепь.

Третья стадия — электронтранспортная цепь (ЭТЦ). Впроцессе окисления пировиноградной кислоты в цикле Кребса образовались пары водорода 2Н, кото­рые мы можем рассматривать как 2Н⁺ + 2е. Именно в таком виде они, акцепти­рованные НАД и ФАД, передаются по цепи переносчиков. В процессе переноса протонов и электронов важную роль играют ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз. Оксидоредуктазы, участвующие в дыхательной цепи, делятся на следующие основные группы.

Пиридиновые дегидрогеназы, у которых коферментом служит НАД или НАДФ, отнимают два протона и два электрона от субстрата. При этом к коферментам присоединяются один протон и два электрона. Протон и один электрон связы­ваются с атомом углерода в молекуле НАД, а второй электрон нейтрализует положительный заряд атома азота. Один протон выделяется в среду.

НАД⁺ и НАДН хорошо растворимы в воде и присутствуют в цитоплазме и мито­хондриях. Коферменты НАД и НАДФ связаны с ферментом с помощью ионов металла и сульфгидрильных группировок. В зависимости от белкового носи­теля, к которому присоединен кофермент (НАД или НАДФ), различают более 150 пиридиновых дегидрогеназ. Каждая из них специфична по отношению к определенному субстрату. Необходимо учитывать, что НАД и НАДФ могут вос­принимать протоны и электроны лишь в том случае, если субстрат имеет более отрицательное значение потенциала по сравнению с ними.

Флавиновые дегидрогеназы. Это также большая группа ферментов, катали­зирующая отнятие двух протонов и двух электронов от различных субстратов. Простетической группой этих ферментов служат производные витамина В₂ (ри­бофлавин) — флавинадениндинуклеотид (ФАД) и флавинмононуклеотид (ФМН). Активной частью флавиновых дегидрогеназ служит изоаллоксазиновое кольцо. В процессе восстановления именно к этой группировке присоединяет­ся 2Н (2Н⁺ + 2ё). Простетическая группа у флавиновых дегидрогеназ прочно прикреплена к белковому носителю. Специфичность и в этом случае определяется белковой частью фермента.

Цитохромы.Простетическая группа цитохромов представлена железопорфи-ринами. Железопорфириновая группа (гем) в цитохромах прочно связана с бел­ком через атомы серы аминокислоты цистеина. Известно около 20 цитохромов, которые делят на четыре главных класса: а, b, с, d, отличающихся между собой природой простетической группы: цитохромы а содержат железоформилпорфи-рины, цитохромы b — железопротопорфирины, цитохромы d — железогидропорфирины. В каждую группу цитохромов входит по нескольку различающихся между собой ферментов. Роль цитохромов заключается в переносе электронов. Содержащееся в цитохромах железо способно к обратимым окислительно-вос­становительным реакциям. Воспринимая электрон, железо восстанавливается, теряя его, окисляется: Fe³⁺ ± е ↔ Fe²⁺. В ЭТЦ митохондрий направление транс­порта электронов определяется величиной окислительно-восстановительного потенциала цитохромов: цит.b→цит.с₁→цит.с→ цит.aa₃→О₂. Непосредствен­но с кислородом воздуха может реагировать только цитохромоксидаза (цитохром аa₃), которая кроме железа содержит атомы меди.

Помимо перечисленных ферментов в переносе электронов по дыхательной цепи принимают участие кофермент Q и железосерные белки. Кофермент Q — это производное бензохинона, получившее название убихинон. Убихинон пред­ставляет собой кольцевую молекулу с двумя присоединенными к ней атомами кислорода, для которой возможны три состояния. В полностью окисленном со­стоянии или хиноновой форме оба атома кислорода связаны с кольцом двой­ными связями. Присоединение одного атома водорода к одному из атомов ки­слорода дает полухиноновую форму QH. В полностью восстановленной форме атомы водорода присоединяются к обоим атомам кислорода. Эта форма носит название гидрохиноновой — QH₂. Таким образом, кофермент Q может присоединять 2 протона и 2 электрона. Убихинон растворим в жирах и в связи с этим подвижен в липидной фазе мембран. Железосерные белки содержат FeS — это переносчики электронов подобно цитохромам. Содержащееся в них железо обратимо восстанавливается и окисляется.

Путь переноса протонов и электронов от одной молекулы переносчика к дру­гой представляет собой окислительно-восстановительный процесс. При этом молекула, отдающая электрон или (и) протон, окисляется, а молекула, воспринимающая электрон или (и) протон, восстанавливается. Движущей силой транспорта электронов в дыхательной цепи является разность потенциа­лов. В связи с этим расположение отдельных переносчиков вдыхательной цепи, так же как и в цепи фотосинтетической, определяется величиной их окис­лительно-восстановительного потенциала (О/В). В начале цепи расположен НАД, обладающий наибольшей отрицательной величиной О/В потенциала (—0,32 В), а в конце—кислород с наиболее положительной величиной (+0,82 В). Остальные переносчики ФАД, КоQ цитохромы расположены между ними в по­рядке последовательного повышения потенциала. Это и позволяет электронам передвигаться по направлению к кислороду (наивысший положительный по­тенциал). Таким образом, роль ферментов дыхательной цепи состоит не только в выполнении каталитической функции, но, что особенно важно, в обеспечении упорядоченного транспорта электронов от одного компонента к другому на ки­слород, что сопровождается запасанием энергии.

В 1939—1940 гг. биохимик В А Белицер указал, что выделяющаяся в процессе передачи по дыхательной цепи электронов энергия частично накапливается в АТФ. При переносе электронов свободная энергия системы постепенно уменьшается. Общее изменение энергии при переносе пары водородов и пары электронов от НАД на кислород можно рассчитывать по формуле: ΔG₀ =nFΔE₀, где n — число элект­ронов, равное 2; F — фарада=96633,97Дж; ΔE₀ — разность потенциалов между участком цепи от -0,32 до +0,82=1,14; ΔG₀ —стандартное изменение свободной энергии, 2*96633,97 Дж 1,14 = 220,8 кДж. Таким образом, изменение свободной энергии системы составляет около 220,8 кДж. Свободная энергия гидролиза АТФ равна 30,6 кДж. Исходя из того, что уменьшение свободной энергии системы при переносе пары электронов с НАД на кислород составляет 220,8 кДж, можно было предположить возможность образования из АДФ + Ф_н семи молекул АТФ. Однако было показано, что при прохождении пары электронов от НАДН до '/₂ О₂ образу­ется всего 3 молекулы АТФ. Из этого был сделан вывод, что в цепи переноса элект­ронов имеется три пункта фосфорилирования.

Окислительное фосфорилирование. Накопление энергии окисления в АТФ при продвижении электрона по цепи переносчиков называют окислительным фос-форилированием. Механизм образования АТФ в процессе окислительного фосфорилирования, так же как и фотофосфорилирования, объяснен благодаря работам английского биохимика П. Митчелла. Его теория получила название хемиосмотической. Для понимания этой теории существенным является пред­ставление о том, что мембраны являются непроницаемыми для протонов. В то же время мембраны хорошо проницаемы для воды и поэтому благодаря диссо­циации в водных растворах нет дефицита протонов.

Согласно хемиосмотической теории свободная энергия, образованная при окислительно-восстановительных реакциях в дыхательной цепи, преобразуется в электрохимический градиент ионов водорода (ΔµН⁺). При этом мембрана пе­реходит в высокоэнергетическое состояние. Ионы Н⁺ (протоны) переносятся с внутренней стороны внутренней мембраны на ее внешнюю сторону (из мат-рикса митохондрии в межмембранное пространство) с помощью переносчиков. ΔµН⁺, в свою очередь, является источником энергии для образования АТФ из АДФ и имеет две составляющие: градиент значения рН и градиент электриче­ского потенциала. Переносчики дыхательной цепи сосредоточены на внутренней мембране митохондрии. При этом они как бы вплетены в митохондриальную мем­брану и составляют дыхательные ансамбли. Так же как в мембранах хлоропластов, переносчики, расположенные в митохондриях, неоднородны. Одни из них пере­носят протоны и электроны, а другие — только электроны. Использование пере­носчиков второго типа (переносящих электрон) возможно потому, что протоны могут находиться в водной среде клетки в свободном состоянии. В мембране мито­хондрии, также как и в мембране хлоропластов, переносчики протонов и электронов чередуются с переносчиками электронов, что имеет принципиальное значение для хемиосмотической теории. Молекула переносчика, несущая протоны и электроны, взаимодействует с переносчиком, воспринимающим только электроны, и прото­ны освобождаются в межмембранное пространство. Именно это, согласно хемиос­мотической теории, лежит в основе преобразования энергии, выделяющейся в про­цессе окисления, в энергию электрохимического мембранного потенциала и далее в энергию АТФ. Согласно теории П. Митчелла, при переносе пары электронов от НАД на кислород они пересекают мембрану 3 раза, и этот перенос сопровождается выделением на внешнюю сторону мембраны 6 (3 пар) протонов.

При рассмотрении рисунков надо учитывать, что это лишь предполо­жительная схема расположения переносчиков. Многое в ней нуждается в уточне­нии. Как видно из приведенной схемы, восстановленный кофермент НАДН+Н⁺, образующийся в реакциях цикла Кребса, располагается на внутренней стороне мем­браны митохондрий. На первом этапе ФАД воспринимает протоны и электроны от НАД и восстанавливается, образуя ФАД*Н₂.

С помощью этого фермента 2Н⁺ пере­носятся на другую (внешнюю) сторону мембраны, и здесь происходит первое раз­деление зарядов. Два протона выделяются на внешнюю сторону внутренней мембра­ны, а электроны присоединяются к переносчику (железосерный белок), с помощью которого переносятся на внутреннюю сторону мембраны. При этом происходит восстановление железа Fе³⁺ + e → Fe²⁺. Этот переносчик переправляет электроны снова на внутреннюю сторону мембраны. Здесь электроны акцептируются KoQ (убихинон — переносчик Н), который, заряжаясь отрицательно, захватывает двумя электронами два протона из внутренней среды. Поскольку KoQ растворим в липи-дах, он диффундирует к внешней стороне мембраны и выделяеттам еще 2Н⁺ (второе разделение зарядов), а электроны передаются на цитохром b.

Рассматривая схему, мы указали на два места выделения (всего четырех) про­тонов. Между тем, согласно хемиосмотической теории, локализация пунктов фосфорилирования в дыхательной цепи определяется пунктами выделения ионов Н⁺. Поскольку, как указывалось выше, показано наличие трех мест фос­форилирования, то необходима транслокация через внутреннюю мембрану трех пар протонов. Однако точно место выделения третьей пары протонов не уста­новлено. Предполагается, что третья пара Н⁺ выделяется также при переносе электронов от KoQ (убихинона) к цитохрому b. При этом участвуют 2 молекулы убихинона, которые сначала переходят в полухинон, а затем в гидрохинон (выделяется третья пара Н⁺). Далее электроны передвигаются по цепи цитохро-мов b → с₁ →с → aa₃, содержащих железо. В каждом из них происходят обрати­мые окислительно-восстановительные превращения железа. На заключитель­ном этапе электроны переносятся ферментом цитохромоксидазой (содержащей наряду с железом медь) на внутреннюю сторону мембраны на кислород. Кисло­род, заряжаясь, воспринимает протоны из внутренней среды с образованием Н₂0: 4Н⁺ + 4е + О₂ → 2Н₂О. В результате выброса ионов Н⁺ на внешнюю сторо­ну мембраны митохондрий и создается электрохимический градиент протонов.

Таким образом, сам механизм процессов, происходящих на мембранах хло-ропластов и митохондрий, сходен. Однако имеются два основных отличия: 1) в случае хлоропластов источником энергии потока электронов служит энергия света, а у митохондрий—энергия окислительных процессов; 2) распределение протонов на мембране противоположно: у митохондрий протоны накаплива­ются на наружной стороне, а у хлоропластов — на внутренней.

Протонный градиент представляет собой как бы резервуар свободной энергии. Эту энергию можно использовать при обратном потоке протонов через мембрану. При этом происходит разрядка мембраны. В частности, энергия может быть затра­чена на синтез АТФ. Процесс синтеза АТФ идет с помощью специального мак-ромолекулярного комплекса, катализирующего синтез и гидролиз молекул АТФ в хлоропластах и митохондриях—АТФ-синтазы. Этот фермент локализован на мем­бранах в виде грибовидных частиц. Мембранная часть АТФ-синтазы («ножка») — фактор сопряжения F₀ — представляет собой гидрофобный белковый комплекс. Фактор сопряжения F₁ —выступает из мембраны в виде «шляпки». За расшифровку структуры комплекса F₁ и установление механизма образования АТФ исследователи Дж. Уокер и П. Бойер в 1997 г. были удостоены Нобелевской премии по химии.

В хлоропластах фактор сопряжения F₁ ориентирован во внешнюю сторону мембран тилакоидов. В митохондриях комплекс F_l обращен в сторону матрикса, т. е. внутренней части митохондрии. Образование АТФ из АДФ и неоргани­ческого фосфата Ф_н происходит в каталитических центрах АТФ-синтазы, рас­положенных в комплексе F_1. В последние годы появились данные о том, что каталитическая активность фермента связана с вращением отдельных субъеди­ниц фактора F₁ АТФ-синтаза — это фермент обратимого действия и в зависи­мости от условий может осуществлять не только синтез АТФ с поглощением, но и ее гидролиз с выделением энергии. Синтез АТФ обеспечивается потоком ионов водорода через АТФ-синтазу, который возникает за счет разности протонных потенциалов (протонный градиент) по обе стороны мембраны.

Существуют две гипотезы, объясняющие механизм синтеза АТФ— прямой и косвенный. Согласно прямому механизму, АДФ и Ф_н связываются с активным центром фермента, куда по каналу поступают протоны. Протоны взаимодействуют с кислородом Ф_н с образованием Н₂О. Это делает Ф_н активным, и он присоединяется к АДФ. После этого молекула АТФ отделяется от фермента.. Согласно второй гипотезе, синтез АТФ из АДФ и Ф_н происходит в активном центре фермента самопроизвольно. Однако образующаяся при этом молекула АТФ прочно связывается с ферментом, поэтому для ее освобождения затрачива­ется энергия протонного градиента. Предполагают, что структурные перестрой­ки фермента, приводящие к высвобождению АТФ, связаны с циклическими про­цессами протонирования и депротонирования функционально важных групп фермента. Как уже обсуждалось, этот механизм в последние годы получил экс­периментальные подтверждения.

Доказательством того, что именно градиент протона обеспечивает фосфори-лирование, являются опыты с разобщителями окисления и фосфорилирования. Как уже упоминалось, к таким разобщителям относится динитрофенол. Оказа­лось, что действие динитрофенола связано с тем, что он делает мембрану про­ницаемой для протонов и тем самым ликвидирует протонный градиент. При этом скорость окисления даже усиливается, однако образование АТФ не происходит. Таким образом, процесс окисления сопряжен с процессом фосфорилирования. Степень сопряженности окисления и фосфорилирования может быть разной в зависимости от условий и от состояния клеток. Показателем сопряженности окисления и фосфорилирования служит коэффициент фосфорилирования Р/О, который соответствует отношению количества связанного неорганического фосфора (АДФ + Ф_н → АТФ) к поглощенному в процессе дыхания кислороду. Как уже рассматривалось выше, перенос двух электронов к кислороду по дыха­тельной цепи сопровождается не более чем тремя фосфорилированиями. Сле­довательно, коэффициент Р/О может быть не более 3. На величину Р/О оказы­вают влияние внешние условия. При засухе окисление усиливается, а накопление энергии в виде АТФ не происходит, коэффициент Р/О резко падает. Коэффици­ент фосфорилирования резко падает и при заболевании организмов. В ряде случаев может наблюдаться непосредственное использование энергии протонно­го градиента (ΔµH⁺). Действительно, поскольку внутренняя сторона мембраны оказывается заряженной отрицательно, возникает трансмембранный потенци­ал. Катионы в силу электрического притяжения могут поступать и накапливаться во внутреннем пространстве митохондрий. Имеются данные, что протонный гра­диент может обеспечить также приток углеводов, в частности поступление саха­розы в ситовидные трубки. Таким образом, ΔµН⁺ обеспечивает осмотическую работу и транспорт веществ против градиента их концентрации. Наконец, по­казана возможность использования ΔµН⁺ на механическую работу (движение бактерий). Вместе с тем важно отметить, что ΔµН⁺ может играть роль как транс­портная форма энергии, передаваясь вдоль мембран (В.П. Скулачев).

Таким образом, клетка обладает двумя формами используемой энергии, дву­мя энергетическими «валютами» — АТФ и ΔµН⁺:

1) АТФ — химическая «валюта», растворимая в воде и легко используемая в водной фазе; 2) ΔµН⁺ — электрохимическая, неразрывно связанная с мембранами. Важно заметить, что эти две формы используемой клеткой энергии могут пере­ходить друг в друга. При образовании АТФ используется энергия ΔµН⁺, при рас­паде АТФ энергия может аккумулироваться в ΔµН⁺.