Ренатурация ДНК с ДНК

Для исследования ренатурации ДНК ее предварительно разрезают на небольшие куски, но 300–600 пар нуклеотидов, денатурируют нагреванием, а затем подвергают длительному отжигу при температуре 70–80°, при которой случайные короткие комплементарные последовательности распадаются, а ренатурируют лишь большие комплементарные участки ДНК, фактически те самые, которые оказались разделенными при денатурации.

Ренатурация ДНК вирусов происходит очень быстро. Так как скорость ренатурации зависит от концентрации ДНК (C₀ ), то точнее говорить, что для вирусной ДНК низко произведение концентрации на время ренатурации (C₀t ). Это и понятно, так как количество генов в геноме вирусов мало (порядка сотни) и вероятность одиночной нити ДНК «найти» «свою» вторую половину достаточно велика. Ренатурация ДНК бактерий происходит значительно дольше – число различных генов и, следовательно, число различных последовательностей ДНК в этом случае выше в десятки раз.

Казалось, можно было предсказать, что ренатурация ДНК животных должна идти еще намного медленнее (величина C₀t должна быть выше). Однако фактически это не совсем так. Определенная часть ДНК (около 10 %) ренатурирует очень быстро, как у вирусов или еще быстрее. Еще некоторая, иногда значительная часть ДНК ренатурирует тоже довольно быстро, хотя и медленнее, чем у вирусов и бактерий. И лишь остальные 50–70 % ДНК (иногда меньше) ренатурируют так медленно, как это и ожидалось (C₀t в 10³раз выше, чем для ДНК бактерий).

Объяснение этому факту – в том, что часть ДНК в геноме животных и растений состоит из повторяющихся последовательностей ДНК. Действительно, если какие‑либо гены повторяются сотни или тысячи раз, то их концентрация в растворе соответственно возрастает и скорость их ренатурации будет выше, чем для генов, которые уникальны, т. е. представлены в геноме только один раз. He все повторяющиеся последовательности являются настоящими генами, т. е. несут информацию о структуре белка. Так, особенно высоко повторяющиеся последовательности (10⁴–10⁵раз на геном) состоят из одинаковых коротких, идущих друг за другом (тандемных) участков и находятся на концах хромосом и в тех точках, к которым прикрепляются нити веретена при митозе. Очевидно, что эти ДНК служат не для кодирования белков, а выполняют в хромосоме какую‑то механическую роль.

Среди умеренных повторов (10²‑10³ раз) роль некоторых известна; Это прежде всего те участки ДНК, которые кодируют РНК для белоксинтезирующей машины. Хотяэти участки ДНК и не кодируют белки, но их тоже часто называют генами. Так, гены больших рРНК (18S и 28S) повторяются от нескольких десятков раз у насекомых до тысяч раз у отдельных рыб и амфибий.

Еще чаще повторяются гены для маленького компонента рибосомной РНК – 5S РНК: у ксенопуса их 24 000, а у человека 2000. Наконец, гены для транспортных РНК(их более 40 видов) также повторяются сотни и тысячи раз, но для разных видов тРНК число этих повторов различно.

Смысл таких повторов для генов рРНК и тРНК, очевидно, состоит в том, чтобы обеспечить достаточное количество рибосом и скорость трансляции на них в тех клетках, где синтез белка особенно интенсивен. В первую очередь это относится к ооцитам, в которых гены больших рРНК еще и амплифицируются (гл. 2).

Оказалось, что повторяются, хотя и не в такой степени, и некоторые настоящие гены, кодирующие белки. В наибольшей степени это относится к генам гистонов: в хромосомах морского ежа каждый из них повторяется несколько сот раз. Гены многих других белков повторяются два– четыре раза.

Эти повторы в ДНК создают определенную проблему для понимания процессов эволюции. С одной стороны они должны замедлять течение эволюции. Случайная мутация, затронувшая один из повторяющихся генов, в принципе не должна подвергаться действию отбора. Так, например, мутация в одном из генов рРНК или в одном из гистоповых генов окажет очень небольшое полезное или вредное влияние на работу рибосом или ядер: ведь вся остальная, подавляющая масса рРНК или гистонов окажется неизменной. Ho если это так, то с течением времени такие «неотбираемые» мутации должны накапливаться в геноме и создавать все большие отличия между ранее одинаковыми генами. Ho в действительности таких различий нет или очень мало. Отсюда возникли предположения, которые уже нашли некоторые фактические подтверждения, о том, что в клетках существует какой‑то механизм коррекции, который исправляет постоянно возникающие отличия между повторами или скорее заменяет каждый набор повторяющихся генов точными копиями одного из них. Тогда в эволюции естественный отбор сохранит лишь те организмы, у которых гены рРНК или гистонов остались неизменными пли стали «лучше», чем были.

Скорость эволюции гистонов очень мала, т. е. они чрезвычайно сходны даже у далеких видов. Это и понятно: у всех животных и растений гистоны тесно связаны с ДНК, химическая природа которой остается неизменной. Очевидно, эволюция гистонов в основном закончилась более миллиарда лет назад, когда возникли эукариоты с настоящими хромосомами. Каждое изменение в структуре гистонов настолько затрагивает все строение и функционирование хромосом, что крайне редко оказывается полезным или хотя бы безвредным.

Ho с другой стороны, повторение некоторых генов, кодирующих белки, открывает для эволюции новые возможности. Если вдоль хромосомы происходит удвоение участка ДНК и появляются два одинаковых гена, то далее один из них может выполнять свою обычную функцию, в то время как второй будет изменяться в эволюции, не нарушая работу клетки убийственным для нее образом. Таким путем, очевидно, возникли варианты одного фермента – изоферменты, а также многие различные сейчас ферменты, имеющие, однако, общие черты строения. Сравнивая порядок аминокислот в разных белках и обнаруживая их большое сходство (такие сравнения сейчас делают на ЭВМ), можно детально проследить, какой белок от какого произошел и примерно когда это было.

Хорошим примером такой молекулярной эволюции могут служить гены, кодирующие белковую часть гемоглобина – глобин. Сейчас насчитывается около десяти видов глобинов, причем одни из них отличаются друг от друга незначительно, а у других произошла замена десятков аминокислот. Большинство из них участвует в образовании гемоглобина крови, но один из них, наиболее отличающийся от других, – миоглобин находится в мышцах.

Возвращаясь к повторяющимся последовательностям ДНК, надо сказать, что сегодня мы можем удовлетворительно объяснить назначение только небольшой их части. Некоторые повторы транскрибируются, но не кодируют белки. Предполагается, что они могут играть регуляторную роль. Ho многие повторы, а их большинство, вообще не транскрибируются, и роль их неизвестна.