Протокол исследования колонии. 5.Прозрачность колоний_________________________________
1.Размер колонии_______________________________________
2.Форма колонии_______________________________________
3. Поверхность колонии_________________________________
4. Края колонии________________________________________
5.Прозрачность колоний_________________________________
6.Пигмент_____________________________________________
7.Консистенция________________________________________
8.Форма бактерий______________________________________
9. Взаиморасположение бактерий_________________________
10.Латинское морфологическое название бактерий__________
3. Для бактериологического исследования используются свежие фекалии, собираемые в стерильную посуду (пробирки или пенициллиновые флаконы) без консерванта. Материал должен быть исследован в течение 2 часов с момента дефекации.
Существует несколько методов исследования микрофлоры кишечника, большинство из которых сводится к количественному исследованию предварительно взвешенной навески фекалий.
Взвешивание проводится на стерильной пергаментной бумаге (навеска должна быть в пределах 0,5-1,0 г.), которая затем помещается в фарфоровую ступку и заливается таким количеством фосфатно-тиогликолевого буфера, чтобы получилось соотношение 1:10. Содержимое ступки тщательно растирается и отстаивается в течение 10 мин для оседания плотных частиц. Затем 0,5 мл содержимого из ступки переносится в пробирку с 4,5 мл фосфатно-тиогликолевого буфера и тщательно перемешивается. В дальнейшем материал последовательно раститровывается по 0,5 мл в 6-ти пробирках (получаются десятикратные разведения). Из 6-й пробирки материал в количестве 0,1 мл переносится в пробирку с 9,9 мл буфера, а из неё 0,1 - в следующую пробирку с аналогичным количеством буфера. Таким образом, в ступке содержится разведение материала 10-1, а в последней пробирке – 10-11. Посев целесообразно начинать с разведения 10-11, используя концевую пипетку на 1,0 мл.
Для выделения бифидобактерий по 0,1 и 1,0 мл из разведений 10-11, 10-9 и 10-7 засевают в пробирки с регенерированной средой Блаурокка; при этом получается 6 пробирок с разведениями от 10-7 до 10-12.
Для выделения бактероидов по 0,1 мл из этих же разведений материала засевают на КАБ (кровяной агар бактероидов) с неомицином и культивируют по модифицированному методу Фортнера: площадь посева закрывают преципитационными (малого диаметра) чашками, создавая строго анаэробные условия, необходимые для культивирования бактероидов.
По 0,1 мл разведений 10-7, 10-6 и 10-5 засевают на молочно-растительную среду /МРС/ - для выделения лактобацилл. Из разведений 10-6 и 10-5 делают посев по 0,1 мл на среду Эндо - для изоляции энтеробактерий; 0,1 мл из разведения 10-6 засевают на кровяной агар - для выявления гемолитической активности аэробной микрофлоры.
Для выявления энтерококков используют среду Калины, засевая по 0,1 мл из разведений 10-6 и 10-5.
По 0,1 мл из разведения 10-4 засевают на чашечную среду Симмонса, позволяющую изолировать наиболее часто встречаемые УПЭ (представителя рода Цитробактер и трибы Клебсиелла) и на желточно-солевой агар - для выделения стафиллококков.
0,1 мл из разведения 10-3 засевают на среду Сабуро с полимиксином - для выделения дрожжей и дрожжеподобных грибов. Для выделения клостридий по 0,1 мл из разведений 10-3 и 10-4 засевают на среду Вильсон-Блера.
Все посевы инкубируют в термостате при 37 °С.
На второй день исследования:
1. Производят учёт роста на среде Эндо. Подсчитывают общее
число, выросших колоний кишечных палочек, обращая внимание на их характер (цвет, наличие металлического блеска, диссоциацию, формы с пониженной ферментативной активностью). При обнаружении лактозоотрицательных колоний анализ ведут как при выявлении патогенных представителей семейства энтеробактерий.
2. Кровяной, желточно-солевой агар и среду Сабуро извлекают из термостата и оставляют для дальнейшей инкубации при комнатной температуре, а желточно-солевой агар - при действии рассеянного света - для лучшего выявления пигментообразования.
На третий день исследования:
1. Производят учёт роста УПЭ на среде Симмонса. Помимо УПЭ (представителей родов Цитробактер, Энтеробактер, Клебсиелла, Гафния, наиболее часто выделяемых из фекалий, а также Провиденсия, изолируемых из этого материала реже), дающих белые или окрашенные в цвет среды мелкие и средней величины слизистые или сухие колонии, часто в R-форме, изменяющие (в случае утилизации цитрата натрия) цвет среды до синего или не изменяющие его, вырастают кишечные палочки, в том числе и с пониженной ферментативной активностью, в виде очень мелких, прозрачных, зеленовато-белых колоний. Подсчитывают общее число колоний УПЭ, выросших на среде Симмонса, - делая перерасчёт на 1 г. В случае роста на чашке колоний УПЭ нескольких типов ведут подсчёт каждого из них и соответствующий пересчёт на 1 г фекалий.
Для идентификации УПЭ производят посев части изучаемой колонии на скошенный МПА, а другой части - на среду Кларка.
2. Учитывают количество колоний стафилококка, подтверждённого изучением морфологии в окрашенном по Граму мазке, на желточно-солевом агаре, делают пересчёт на 1 г, определяют пигментообразование и образование лецитиназы (лецитовителлазы), производят отсев колонии для выделения чистой культуры и дальнейшего определения вида стафилококка.
3. Производят подсчёт числа колоний энтерококка на среде Калины (с пересчётом на 1 г), определяют наличие или отсутствие протеолитической активности.
4. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза, в положительном случае определяют морфологию микроорганизма; подсчитывают % гемолитических форм к общему количеству выросших на этой среде колоний.
5. Отмечают наличие чёрных колоний на среде Вильсон-Блера, подсчитывают их общее количество (с переводом на 1 г), подтверждают принадлежность выросших микроорганизмов к клостридиям изучением морфологии в окрашенном по Граму мазке. Нередко на этой среде вырастают, представители рода Протеус и Цитробактер, давая колонии, схожие с колониями клостридий.
6. Регистрируют рост на среде Сабуро с полимиксином, где вырастают дрожжи и дрожжеподобные грибы, давая белые средней величины и крупные колонии. Морфологию микроорганизмов подтверждают микроскопией окрашенных по Граму препаратов. Определяют общее количество выросших колоний, делают пересчёт на 1 г, а для дифференциации дрожжей от дрожжеподобных грибов рода Кандида, делают посев на картофельный или крахмальный агар (для определения филаментации, характерной для грибов рода Кандида и отсутствующей у дрожжей).
На четвёртый день исследования:
I. Учитывают рост бифидобактерий на среде Блаурокка. Для этого из каждой пробирки с ростом готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При микроскопии препаратов отмечается характерная для бифидобактерий морфология и расположение. Учитывают предельное разведение материала, в котором ещё регистрируется рост бифидобактерий, подтверждённый нахождением этих микроорганизмов в окрашенных по Граму препаратах. При этом, не допуская большую ошибку, можно перевести предельное разведение материала на количество бифидобактерий в 1 г фекалий. Допустим, предельным разведением материала, в котором зарегистрирован рост бифидобактерий, подтверждённый изучением морфологии в мазке, было 10-10. С большой долей вероятности можно считать, что количество бифидобактерий в 1 г фекалий соответствует 1010 (этот пересчёт необходим для дальнейшего определения соотношения бифидобактерий и других микроорганизмов).
2. Регистрируют рост лактобацилл на МРС, подсчитывают общее число колоний этих микроорганизмов, приводят к 1 г. Лактобациллы на МРС растут в виде мелких беловато-серых с ровными краями или более крупных желтовато-серых с изведенными краями колоний, дифференцировать которые от колоний других микроорганизмов не предоставляет особого труда. Лактобациллы довольно хорошо растут на среде Сабуро с полимиксином.
3. Производят учёт бактероидов на КАБах. На этой среде указанные микроорганизмы растут в виде мелких беловато-серых колоний; в мазке - это грамоотрицательные мелкие палочки, расположенные без особого порядка. Делают пересчёт для определения количества бактероидов в 1 г фекалий. Для дифференциации бактероидов от лактобацилл, спорообразующих бактерий и др. микроорганизмов производят посев части колонии на КАБ с последующим культивированием в аэробных условиях, а также окраску, на выявление спор.
4. Повторно учитывают рост грибов рода Кандида на среде Сабуро с полимиксином (при отсутствии роста на этой среде через 24-48 часов); при наличии роста, производят изучение как в п.6 третьего дня исследования.
5. Для идентификации УПЭ производят посев чистой культуры со скошенного МПА на среды с аминокислотами (лизином, аргинином, орнитином).
На пятый день исследования:
1. Производят учёт филаментации (если предварительно были подозрительные колонии на среде Сабуро).
2. Учитывают тесты, дифференцирующие бактероиды от лактобацилл и аэробов (по отсутствию роста на МРС и на КАБах в аэробных условиях).
3. Для идентификации УПЭ производят учёт изменений со сред с аминокислотами, а также результатов реакции Фогес-Проскауэра и с метиловым красным, что в ряде случаев даст возможность установить род и вид; в том случае, когда идентификацию по указанным тестам провести не удаётся, проводят посев на дополнительные углеводы.
4. Выдача ответа.
В ответе следует указать количество анаэробов (бифидобактерий, бактероидов, лактобацилл), а также количество аэробных микроорганизмов различных родов, изолированных из 1г фекалий.
В заключении следует указать на отсутствие или наличие дисбактериоза кишечника и степень его выраженности.
Основой для заключения должно быть соотношение количества бифидобактерий (как основных представителей анаэробной группы бактерий, выполняющих наиболее важную для организма физиологическую функцию) и аэробов.
При установлении пограничных состояний между нормой и патологией очень важным показателем является соотношение между бифидобактериями и E.coli.
Для его установления количество бифидобактерий, определённых в конкретном образце, подтверждённых изучением морфологии в окрашенных по Граму препаратах, принимают за 100 %, а количество E. coli за Х. Составляют пропорцию и высчитывают значение X.
Например, количество бифидобактерий в I г = 1010, а количество E. coli = 700 млн.
Составляем пропорцию:
1010 ------ 100 %
700 млн ----- X
X = 7 %
Данный показатель превышает норму (5 %) и свидетельствует о начальных сдвигах в микрофлоре (нарушение соотношения между бифидобактериями и E. coli), что может быть определено как дисбактериоз I степени. Однако такие расчёты следует проводить не во всех случаях, а только тогда, когда имеются затруднения в дифференциации дисбактериоза I степени и эубиоза.
Дата добавления: 2015-02-16; просмотров: 1548;