Методы изучения и диагностики наследственных патологий

В настоящем разделе представлена краткая характеристика генетико-эпидемиологического подхода в изучении наследственных болезней (генетический, близнецовый и популяционностатистические методы), методы клинической диагностики (клиническое обследование и параклинические исследования), лабораторные методы диагностики (цитогенетические, биохимические, молекулярно-генетические) и методы моделирования наследственных болезней в эксперименте на животных.

Генетико-эпидемиологический подходв изучении роли наследственности в этиологии и патогенезе болезней человека предполагает совместное применение генеалогического, близнецового и популяционно-статистических методов.

Генеалогический метод - метод родословных, т.е. прослеживание болезни (или признака) в семье или роду с указанием типа родословных связей между членами родословной. Технически он складывается из двух этапов: составления родословной и генеалогического анализа. На первом этапе, используя специальные символы и правила, которые достаточно хорошо известны, составляется родословная.

Второй этап (генеалогический анализ) позволяет решать несколько задач. Во-первых, установить наследственный характер болезни или признака. Наследственную природу анализируемых болезней (признаков) предполагают, если они повторяются в родословной несколько раз (рис. 5-12). Во-вторых, в случае доказательства наследственного характера болезни возможно установление типа наследования (аутосомно-доминантный, аутосомнорецессивный, Х-сцепленный, Y-сцепленный, митохондриальный). Наконец, анализ родословных является обязательным условием успешного решения задач картирования генов на хромосомах, расшифровки механизмов взаимодействия генов, изучения интенсивности мутационного процесса. В клинической практике генеалогический анализ составляет основу осуществления медикогенетического консультирования.

Близнецовый метод. Возможности его использования при изучении наследственной патологии определяются представлениями о происхождении близнецов: партнеры однозиготной (монозиготной) пары близнецов являются генетически тождественными, поскольку образуются из одной зиготы; партнеры двузиготной

Рис. 5-12.Габсбургская губа, прослеженная на протяжении столетий: а - император Максимилиан IV (1459-1519); б - император Карл V - внук (а) (1500-1558); в - эрцгерцог Карл Тешенский (1771-1847); г - эрцгерцог Альбрехт - сын (в) (1817- 1895). Strohmayer, Nova Acta Leopoldina, 5, 1937 (из книги К. Штерна «Основы генетики человека. М.: Медгиз, 1965. CV.95)

(дизиготной) пары близнецов образуются из двух разных зигот, а потому их фенотипическое сходство не больше, чем у братьев и сестер, родившихся в разное время; пары разнополых близнецов всегда являются двузиготными; внутрипарное различие, обнаруживаемое по какой-либо нормальной или патологической особенности однозиготных близнецов, должно быть отнесено за счет различий, обусловленных факторами среды.

Близнецовый метод считается особенно эффективным для доказательства наследственной предрасположенности к конкретным заболеваниям (мультифакториальные болезни и комплексные признаки). В этом случае применяют два варианта сравнения: сравнение конкордантности (совпадения фенотипов) моно- и дизиготных близнецов; сравнение конкордантности вместе и порознь выросших монозиготных близнецов. Обобщенные результаты использования близнецового метода для понимания природы разных заболеваний представлены в табл. 5-7.

Популяционно-статистические методы. В отношении моногенных (менделевских) болезней эти методы в сравнительных ис-

следованиях различных групп населения (популяций, этносов) позволяют выявить и оценить наиболее важные факторы популяционной динамики (отбор, дрейф генов, инбридинг, давление мутаций), определяющие пространственную изменчивость (территориальную гетерогенность в распространенности) наследственных болезней. Например, показано, что накопление некоторых рецессивных болезней среди финноязычного населения Финляндии обусловлено длительной изоляцией субпопуляций и дрейфом генов. Накопление редких патологических мутаций среди евреевашкенази объясняется эффектом «родоначальника» и дрейфом генов. Для популяций Средней Азии, а также некоторых арабских популяций показано, что главным фактором, детерминирующим груз и структуру наследственных болезней, накопление аутосомнорецессивной патологии, являются неслучайные родственные браки (ассортативность браков).

Таблица 5-7.Конкордантность (%) близнецовых пар для разных групп болезней

Для других форм патологии - мультифакториальных заболеваний (болезней с наследственным предрасположением) популяционно-статистические методы, наряду с использованием современных молекулярно-генетических методов, позволяют на основе анализа ассоциаций и сцепления генетических маркеров с конкретными признаками и болезнями в сравниваемых группах «больные - здоровые» («случай - контроль») в популяции, «больные - здоровые» в ядерных семьях, принадлежащих данной популяции, осуществлять поиск «генов-кандидатов» исследуемой болезни.

Методы клинической диагностики.Наследственная патология имеет некоторые специфические характеристики. Для их выявления используется весь арсенал методов клинической диагностики (анамнез, осмотр, физические методы и пр.), параклинические ис-

следования (общеклиническая диагностика с использованием современной аппаратуры исследования отдельных органов и систем - R-логические, ультразвуковые, томографические и т.д.). Главный смысл их применения (и выбор оптимальных клинических приемов) - обнаружить специфические черты болезни, указывающие на наследственный характер поражения. К ним относятся: семейный характер заболевания; хроническое, прогредиентное, рецидивирующее течение; врожденный характер заболевания; «резистентность» к наиболее распространенным методам терапии; наличие патогномоничных признаков (или их сочетаний), свойственных только данной форме наследственной патологии. Именно последнее, обусловленное тем, что большинство мутантных генов, вызывающих наследственные болезни, обладает плейотропным эффектом и вовлечением в процесс многих органов и систем (неспецифичных ассоциаций), определяет необходимость применения параклинических методов исследования. Так, при таких наследственных болезнях соединительной ткани, как синдром Элерса-Данлоса, Марфана, для которых характерно нарушение сосудистой стенки (особенно аорты), подвывих хрусталика, пролапс митрального клапана, патология суставов, понадобятся R-логические, ультразвуковые, офтальмоскопические и некоторые другие параклинические методы исследования. Однако окончательная диагностика и выявление более тонких генетических вариантов исследованной патологии осуществляются с применением специальных лабораторных методов диагностики.

Лабораторные методы диагностики.Лабораторная диагностика наследственных болезней (феноили генотипирование индивидов) в основе своей может быть направлена на идентификацию одной из трех «ступеней» болезни. Во-первых, это выявление этиологической причины наследственной патологии, или характеристика генотипа, т.е. определение конкретной мутации у индивида (генной, хромосомной, геномной). Эти цели достигаются с помощью цитогенетических или молекулярно-генетических методов. Во-вторых, лабораторные методы позволяют регистрировать первичный продукт гена (биохимические, иммунологические методы). В-третьих, возможна регистрация специфических метаболитов измененного обмена, возникших в процессе реализации патологического действия мутации (биохимические, иммунологические, цитологические методы регистрации на уровне жидкостей - кровь, моча, секрет - или клеток).

Цитогенетические методы. Они предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом. Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Чаще исследования выполняются на соматических клетках: наиболее удобный объект - культура лимфоцитов периферической крови, но также и культура клеток из кусочков кожи (фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости.

Специальным образом полученные препараты из культуры клеток затем окрашиваются. Все методы окраски препаратов можно разделить на три группы: простые, дифференциальные, флюоресцентные.

Простая окраска (метод окраски по Гимзе или в русскоязычной литературе - «рутинная окраска») используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа. Структурные хромосомные аномалии (делеции, транслокации, инверсии), выявленные при простой окраске, должны быть идентифицированы с помощью дифференциальной окраски. Под этим методом понимают способность хромосом к избирательному окрашиванию по длине с фиксацией в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (темные и светлые полосы).

Благодаря успехам в молекулярной генетике человека разработан принципиально новый метод изучения хромосом - метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Он основан на использовании однонитевого специфического участка ДНК («зонда»), специальным образом «помеченного» и способного, после присоединения к участку анализируемой хромосомы, присоединить флюоресцентные красители (красный, зеленый и другие цвета). С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуализируются на фоне неокрашенных. Метод позволяет расшифровать сложные хромосомные перестройки, а также локализовать ген.

Биохимические методы. Эти методы: направлены на вышвление биохимического фенотипа организма - от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в моче или поте. Поэтому существует огромное разнообразие методов. Но для целей диагностики наследственных болезней оправданными являются две биохимические стратегии, которые позволяют определить дальнейший ход обследования и выбор соответствующих биохими-

ческих методов и тестов: массовые и селективные программы первичной биохимической диагностики наследственных болезней.

Массовые просеивающие программы применяются в диагностике фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, адреногенитального синдрома, врожденных аномалий нервной трубки и болезни Дауна. Селективные диагностические программы предусматривают проверку, уточнение биохимических аномалий обмена для пациентов, у которых подозреваются генные болезни, с использованием простых качественных реакций или более точных методов (тонкослойная хроматография мочи и крови, газовая хроматография, флюорометрические методики и др.).

Молекулярно-генетические методы. Это большая и разнообразная группа методов, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности нуклеотидных оснований. Все разнообразие подходов для идентификации генов или определенных фрагментов ДНК и их вариаций основывается на двух основных методических разработках - технологии блот-гибридизации (от англ. blot - промокать) и амплификации отдельных участков ДНК.

В основу методики амплификации положена полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет в течение нескольких часов выделить и размножить определенный фрагмент ДНК в количестве, превышающем исходное в 10⁹ раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает работу с минимальными количествами ДНК-образцов. Реакция высокоспецифична и чувствительна, позволяет исследовать единичную копию гена в исходном материале.

В табл. 5-8 приводятся другие методы генотипирования, основанные главным образом на этих же двух технологиях, а также обозначены подходы к ДНК-диагностике болезней (прямая и косвенная диагностика).

Методы моделирования.Как и в других разделах биологии и медицины, в генетике человека и медицинской генетике широко применяются методы моделирования. Они разделяются на две группы: биологические и математические.

Таблица 5-8.Подходы к ДНК-диагностике наследственных болезней

Для изучения многих моногенных болезней человека используются животные, несущие мутации в гомологичных генах. Они являются удобными моделями для исследования молекулярных основ патогенеза и отработки оптимальных вариантов лечения. С этой целью во многих питомниках мира созданы и поддерживаются коллекции генетических линий животных(мышей, крыс, кроликов, собак и др.). Мировая коллекция мышей насчитывает несколько сотен линий с моногенно наследуемыми дефектами.

Для анализа экспрессии мутантных генов in vivo и оценки биологических свойств первичного генного продукта удобными оказались трансгенные животные.Трансгенных животных получают искусственным введением (трансгеноз) генетического материала (фрагмент гена или иная последовательность ДНК) в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Дальнейшее развитие технологий трансгеноза позволило подойти к конструированию модельных генетических линий животных- на-

правленному получению генетических моделей наследственных болезней путем введения сайтспецифических модификаций в геном млекопитающих, или «выбиванию» (вырезанию) определенного гена, идентичного гену человека. Такие мыши, у которых экспериментально «вырезан» определенный ген из генома, называются нокаутными (от англ. knock out). На этих животных можно приближенно понять патогенез наследственной болезни и апробировать методы лечения.

Математическое моделирование применяют в тех случаях, когда сформулированные задачи не могут быть решены только путем анализа экспериментального материала или их решение математически оказывается более быстрым и точным, чем экспериментально. В области генетики популяций математическое моделирование позволяет, например, оценить удельный вес многочисленных факторов популяционной динамики (отбор, мутации, дрейф генов, инбридинг, миграции) в формировании «груза» наследственной патологии. Изучение таких сложных процессов, как взаимодействие наследственных факторов и факторов среды в развитии признака, закономерностей функционирования генома человека как интегративной системы, взаимодействие генов («генные сети») при формировании физиологических свойств организма, становится предметом исследования биоинформатики (компьютерной геномики).