Световая микроскопия

Самым древним и, вместе с тем, наиболее распространенным методом изучения клетки является микроскопия. Можно сказать, что и начало изучения клетки было положено изобретением светового оптического микроскопа.

Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм. Это означает, что если вы смотрите на две линии, которые находятся друг от друга на расстоянии меньше 0,1 мм, они сливаются в одну. Чтобы различить структуры, расположенные более тесно, применяют оптические приборы, например, микроскоп.

Но возможности светового микроскопа не безграничны. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, то есть оптический микроскоп может быть использован только для изучения таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны светового излучения. Лучший световой микроскоп имеет разрешающую способность около 0.2 мкм (или 200 нм), то есть примерно в 500 раз улучшает человеческий глаз. Теоретически построить световой микроскоп с большим разрешением невозможно.

Многие компоненты клетки близки по своей оптической плотности и без специальной обработки практически не видны в обычный световой микроскоп. Для того, чтобы сделать их видимыми, используют различные красители, обладающие определенной избирательностью.

В начале XIX в. Возникла потребность в красителях для окрашивания текстильных тканей, что в свою очередь вызвало ускоренное развитие органической химии. Оказалось, что некоторые из этих красителей окрашивают и биологические ткани и, что было уж совсем неожиданно, часто предпочтительно связываются с определенными компонентами клетки. Использование таких избирательных красителей дает возможность более тонко исследовать внутреннее строение клетки. Приведем лишь несколько примеров:

	краситель гематоксилин окрашивает некоторые компоненты ядра в синий или фиолетовый цвет;
	после обработки последовательно флороглюцином и затем соляной кислотой одревесневшие оболочки клеток становятся вишнево - красными;
	краситель судан III окращивает опробковевшие клеточные оболочки в розовый цвет;
	слабый раствор йода в йодистом калии окрашивает крахмальные зерна в синий цвет.

Для проведения микроскопических исследований большую часть тканей перед окраской фиксируют. После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, а структура клетки стабилизируется. Одним из наиболее распространенных фиксаторов в ботанике является этиловый спирт.

Фиксация и окрашивание не единственные процедуры, используемые для приготовления препаратов. Толщина большинства тканей слишком велика, чтобы их сразу можно было наблюдать при высоком разрешении. Поэтому выполняют тонкие срезы на микротоме. В этом приборе использован принцип хлеборезки. Для растительных тканей изготавливают чуть более толстые срезы, чем для животных, поскольку клетки растений обычно крупнее. Толщина срезов растительных тканей для световой микроскопии около 10 мкм - 20 мкм. Некоторые ткани слишком мягкие, чтобы из них сразу же можно было получить срезы. Поэтому после фиксации их заливают в расплавленный парафин или специальную смолу, которые пропитывают всю ткань. После охлаждения образуется твердый блок, который затем режется на микротоме. Правда, для растительных тканей заливка применяется значительно реже, чем для животных. Это объясняется тем, что растительные клетки имеют прочные клеточные стенки, составляющие каркас ткани. Особенно прочны одревесневшие оболочки.

Однако заливка может нарушить структуру клетки, поэтому применяют еще и другой метод, где эта опасность уменьшена ? быстрое замораживание. Здесь можно обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань режут на специальном микротоме (криотоме).

Замороженные срезы, приготовленные таким способом, имеют явное преимущество, поскольку в них лучше сохраняются особенности естественной структуры. Однако их труднее готовить, а присутствие кристаллов льда все же нарушает некоторые детали.

Микроскопистов всегда беспокоила возможность потери и искажения некоторых компонентов клетки в процессе фиксации и окраски. Поэтому полученные результаты проверяют другими методами.

Весьма заманчивой представлялась возможность исследовать под микроскопом живые клетки, но так, чтобы более отчетливо проявились детали их строения. Такую возможность дают особые оптические системы: фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Хорошо известно, что световые волны, подобно волнам воды, могут интерферировать друг с другом, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. В обычном микроскопе, проходя через отдельные компоненты клетки, световые волны меняют свою фазу, хотя человеческий глаз этих различий не улавливает. Но за счет интерференции можно преобразовать волны, и тогда разные компоненты клетки можно отличить друг от друга под микроскопом, не прибегая к окрашиванию. В этих микроскопах используют 2 пучка световых волн, которые взаимодействуют (налагаются) друг на друга, усиливая или уменьшая амплитуду волн, поступающих в глаз от разных компонентов клетки.