Производство антибиотика пенициллина

Производство антибиотика пенициллина — хороший пример использования периодического культивирования с добавлением субстрата для получения вторичного метаболита.

Для производства пенициллина используют специально отобранные расы плесневых грибов-суперпродуцентов, принадлежащие к роду Penicillium. Для промышленного производства пенициллина применяют биореакторы с механическим перемешиванием, объемом свыше 10000дм³.

Решающее значение имеет состав среды, используемой в процессе ферментации. Питательная среда, используемая для производства пенициллина, обычно содержит кукурузный экстракт, лактозу, глюкозу и др. Предпочтительным источником углерода является глюкоза. Глюкоза обеспечивает рост гриба, однако подавляет продукцию ферментов, необходимых для синтеза пенициллина. Поэтому обычно стимулируют быстрый рост гриба в первые 30—40 ч, а затем добавляют глюкозу в низкой концентрации либо контролируемыми дозами, либо постоянно (т.е. это периодическое культивирование с добавлением субстрата). Источником азота является дешевый белок, например соевая или рыбная мука. Кроме того, в среду добавляют фосфат, карбонат кальция и фенилуксусную кислоту, которые повышают выход продукта, так как они необходимы для образования молекулы пенициллина. Поскольку пенициллин является вторичным метаболитом, он образуется уже после начальной, быстрой фазы роста. К первичным метаболитам, которые формируются на первой фазе роста, относятся, например, такие продукты дыхания, как двуокись углерода и этиловый спирт.

Посевной материал выращивают из спор гриба. Для инокуляции ферментера объемом 50 000 дм³ требуется 3—5 тонн мицелия. Поскольку пенициллин необходим в огромных количествах, для его производства построен ферментер объемом до 200000 дм³. Ежедневно потребляется около 500 кг глюкозы. Выход пенициллина сильно зависит от температуры, которая может подниматься до 2°С в час, поэтому нужно внимательно следить за этим фактором. Необходимо также контролировать значение рН и поддерживать его между 6,5 и 7,0. Процесс продолжается примерно 15 сут.

После стерилизации и охлаждения среда засевается поросшими спорами гриба, аэрируется путем пропускания через нее воздуха и перемешивается с помощью мешалки. Температуру культивирования поддерживают в пределах 24-25⁰С. Для предотвращения чрезмерного образования пены применяют химические пеногасители.

Дальнейшая переработка начинается с удаления мицелия путем вакуумной фильтрацией или центрифугированием. Пенициллин остается растворенным в жидкой фазе среды. Его экстрагируют серией растворителей. При каждой экстракции удаляется часть примесей, так что пенициллин становится все чище и чище, пока он не окажется растворенным в воде в чистом виде. Затем воду удаляют путем выпаривания в вакууме, а пенициллин кристаллизуется в виде натриевой или калиевой соли (сам по себе пенициллин является слабой кислотой).

Бутилацетат Обедненный раствор на сток

Бутилацетат

Уголь

Отработанный уголь (сорбент)

Концентрат калиевой соли

Бутиловый спирт Темп. 16-26⁰С

Рисунок 5 – Схема производства пенициллина

1 – пар; 2- контроль воздуха; 3 – конденсат; 4 – биореактор; 5 – направляющий рукав; 6 – вращающийся барабан; 7 – холодильник; 8 – непрерывный вакуумный фильтр; 9 – адсорбция на угле; 10 – вакуум –испаритель с нагреванием; 11 – ацетон; 12 – фильтрация и элюция ацетоном; 13 – из запасного резервуара; 14 – к запасному резервуару; 15 – холодная вода; 16 – сгуститель; 17 - амилацетат; 18 - смеситель; 19 – шланг; 20 – первая стадия; 21 – вторая стадия; 22 – третья стадия; 23 – фракционная колонка; 24 – отгон амилацетата; 25 – приемник; 26 – вакуум-испаритель; 27 – отстойник; 28 – регенерация ацетона

5 ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ ПЕРИОДИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ С ДОБАВЛЕНИЕМ СУБСТРАТА, ПО СРАВНЕНИЮ С ТРАДИЦИОННЫМ ПЕРИОДИЧЕСКИМ КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ.

В настоящее время все более популярным становится периодическое культивирование с добавлением субстрата, которое представляет собой компромисс между двумя системами, периодическим и непрерывным культивированием. Использование периодического культивирования с добавлением субстрата делает процесс более контролируемым по сравнению с периодическим культивированием.

Простое периодическое культивирование характеризуется ростом клеток без подачи дополнительных порций субстрата после посева культуры. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса. Для предотвращения негативных последствий лимита субстрата применяется техника культивирования с подпиткой, при этом субстрат или другие необходимые компоненты добавляются либо непрерывно, либо по сигналу от какого-либо датчика. Период роста клеток удлиняется за счет того, что питательные вещества добавляются в низких концентрациях в процессе ферментации, а не вносятся все сразу в начале процесса, повышается выход внеклеточных метаболитов.

Одним из преимуществ метода является возможность регулирования скорости роста, которую можно соизмерять со скоростью подачи кислорода. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта. Этот процесс обычно используется в производстве дрожжевых клеток для пекарной промышленности. Если к дрожжевым клеткам добавляют слишком много сахара, они начинают дышать анаэробно и образуют вместо биомассы спирт.

Настоящее периодическое культивирование с подпиткой требует, чтобы объем жидкой среды в ферментере увеличивался. Это требование обусловливает верхний предел времени культивирования, определяемый скоростью подпитки, а также изменение условий аэрации и эффективности перемешивания. Кроме того, при этом не исключена возможность обратного заражения свежей среды в сборнике из ферментера; поэтому желательно использовать прерыватель подачи среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивирование микроорганизмов – процесс выращивания микроорганизмов в (на) питательной среде, в результате которого происходит размножение и накопление биомассы микроорганизмов и продуктов метаболизма (продуктов микробного синтеза) микроорганизмов.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов.

Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются, в основном, на стадии культивирования.

Культивирование микроорганизмов осуществляется различными способами. По способу организациипроцесс культивирования может быть периодический с добавлением субстрата.

При таком культивировании часть среды загружается в начале ферментации, а другая часть добавляется непрерывно по мере протекания процесса. Естественным завершением процесса является переполнение аппарата, поэтому необходимо переходить на строго периодический процесс с максимальным объемом среды и быстро завершать его.

Одним из преимуществ метода является возможность регулирования скорости роста, которую можно соизмерять со скоростью подачи кислорода. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта.

Периодическое культивирование с подпиткой требует, чтобы объем жидкой среды в ферментере увеличивался. Это требование обусловливает верхний предел времени культивирования, определяемый скоростью подпитки, а также изменение условий аэрации и эффективности перемешивания. Кроме того, при этом не исключена возможность обратного заражения свежей среды в сборнике из ферментера.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии – М., 2004г

2. Евтушенко А.Н. Введение в биотехнологию: Курс лекций - Мн.: БГУ, 2002.

3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках - М.: Высшая школа, 1989г.

4. Муратова Е.И. Биотехнология органических кислот и белковых препаратов: учебное пособие - Тамбов: Изд-во Тамбовского государственного технического университета, 2007

5. Тихонов И.В. Биотехнология: Учебник – СПб.: ГИОРД, 2005г