Картирование.

1) Генетические карты – определение групп сцепления и положения картируемого гена относительно других генов данной хромосомы. На первом этапе определяют принадлежность гена к той или иной группе сцепления. Картирование мутации основывается на анализе её сцепления с маркёром (необходимы маркёрные гены для каждой хромосомы)Если интересующая нас мутация наследуется независимо от маркёров втрой хромосомы, делается вывод о её принадлежности к другой группе сцепления. Скрещивания проводятся до тех пор, пока не удаётся выявить сцепленное наследование аналиируемой мутации с маркёрными мутациями какой-либо хромосомы. Второй этап – определение положения гена на хромосоме – подсчёт расстония между искомым и известным маркёром. Проводят специальное скрещивание, где четыре кроссоверных и некроссоверных особей.РАсстояние между генами пропорционально частоте кроссинговера.

2) Цитологические карты – метод основан на использовании хромосомных перестроек. При действии метагенов наблюдаются делеции или дупликации небольших фрагментов, сравнимых по величине с одним или несколькими локусами. Метод перекрывающихся делеций (ABDE/abde), транслокаций и инверсий.

3) физическое картирование – расщепляют фрагементы на части (рекомбинационное). Фермент картирование п. Участков. Предел дробления – нуклеотидная последовательность.

4) Новые методы – гибридизация in situ. Получают иРНК, транскрибированную с этого гена, а затем с помощью обратной транскриптазы её ДНК-копию.

Затем прободят гибридизацию с денатурированной хромосомной ДНК и по месту гибридизации определяют, в каком участке хромосомы локализован данный ген.

Сотрудник Моргана А. Стертевант предположил, что частота кроссинговера на участке между генами, локализованными в одной хромосоме, может служить мерой расстояния, на котором они находятся друг от друга. Он провел анализирующее тригибридное скрещивание, в котором родительские формы различаются по генам b (black – окраска тела), vg (vestigial – форма крыльев) и pr (purple – окраска глаз), сцепленными друг с другом. Далее он определил частоту кроссинговера между всеми тремя генами попарно. И на основе этих данных, пользуясь правилом аддитивности, расположил три гена в линейной последовательности (сумма частот рекомбинации между pr и b, pr и vg приблизительно равна частоте рекомбинации между b и vg, pr находится между b и vg). Так строится простейшая карта группы сцепления (генетическая карта). В строгом смысле группа сцепления – группа генов, проявляющих сцепленное наследование. Но так как такое наследование отражает локализацию генов в одной хромосоме, обычно под группой сцепления понимают группу генов, расположенных в одной хромосоме. Но иногда гены, расположенные в одной хромосоме, не обнаруживают сцепления. Генетическое расстояние, на котором кроссинговер происходит с вероятностью 1%, - 1 сантиморган (сМ).

Между любыми двумя сцепленными генами возможен не только одиночный, но и двойной (или множественный) кроссинговер, что приводит к сокращению регистрируемой частоты кроссинговера и, следовательно, расстояния между генами на карте. Кроме того, между обменами на соседних участках хромосом существует взаимовлияние – интерференция (I), степень и характер которой измеряется величиной коинциденции (С). Коинциденция – частное от деления реально наблюдаемой частоты двойных кроссинговеров на теоретически ожидаемую частоту (если обмены на соседних участках происходят независимо друг от друга). I=1-C. Если C<1, то интерференция положительная, то есть одиночный обмен препятствует обмену на соседнем участке хромосомы. Если C>1, то интерференция отрицательная, о есть один обмен как бы стимулирует дополнительные обмены на соседних участках. В действительности при кроссинговере существует только положительная интерференция.

Т. о., при картировании надо учитывать противоположные тенденции (двойные обмены («сокращение» расстояния между генами) и интерференцию (препятствие множественным обменам, вероятность которых увеличивается с расстоянием)). У дрозофилы на больших расстояниях (35% рекомбинации) интерференция исчезает (Меллер). Следовательно, наиболее точные данные о частоте кроссинговера можно получить только на коротких расстояниях – около 10сМ.

Функция Дж. Холдэйна описывает зависимость частоты рекомбинации от реального расстояния с учетом множественных обменов: rf(d)=(1-e^-2d)/2, где rf - картирующая функция (частота учитываемых кроссинговеров), d – реальное расстояние, на котором происходят обмены, е – основание натурального логарифма. Функция Холдэйна показывает, что с увеличением расстояния rf приближается к 0,5. То есть между генами, расположенными далеко друг от друга, выявляется около 50 единиц рекомбинации (такая же частота у генов, находящихся в разных хромосомах). Между такими генами нельзя уловить сцепления; несмотря на физическое сцепление, они будут наследоваться независимо.

Составление цитологических карт удобно для объектов, у которых наиболее четко различима продольная дифференцировка хромосом по хромомерному строению, как это видно в пахитене у кукурузы. Очень удобны гигантские хромосомы дрозофилы, где хорошо различимы диски гетерохроматина и междисковые участки эухроматина.

Установление точек действия различных рестриктаз позволяет проводить физическое (рестрикционное) картирование участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов). Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) разрезают ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нуклеотидов, которые одинаковы на обеих комплементарных цепях. Два разрыва в одинаковых позициях комплементарных цепей на концах фрагмента образуют «липкие концы», которые могут вновь замыкаться благодаря комплементарности оснований. Последовательности, узнаваемые рестриктазами, статистически разбросаны по геному. Чем короче последовательность, тем чаще она встречается и, соответственно, тем короче фрагменты ДНК, образующиеся при рестрикции. Фрагменты рестрикции (рестрикты) можно разделить по их молекулярной массе и заряду при помощи электрофореза в геле. Распределение сайтов рестрикции – своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК – может быть использовано для его идентификации. Принцип рестрикционного картирования сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Молекулярную массу фрагментов определяют, использую в качестве «свидетеля» ДНК известного размера. На электрофореграмме рестрикты различают, окрашивая их бромистым этидием и просматривая гель в УФ свете. Применяют также радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4.

Непосредственно для картирования сайтов рестрикции используют метод неполного гидролиза одной рестриктазой или метод двух рестриктаз. В случае неполного гидролиза молекулы, имеющей два сайта рестрикции, будет получаться пять фрагментов – пять полос при электрофорезе плюс еще одна полоса интактных молекул. В простейшем случае по распределению молекулярных масс удается определить взаимное расположение фрагментов. Можно также извлечь из геля продукты неполного гидролиза и еще раз подвергнуть их действию рестриктазы.

При использовании двух рестриктаз ДНК гидролизуют каждой рестриктазой по отдельности и обеими рестриктазами вместе. Предположим, что одну и ту же молекулу одна рестриктаза режет на два фрагмента (А и С), а другая – на три (А, В и С). При совместном их действии исчезает фрагмент В и появляются два новых, по молекулярной массе в сумме составляющих исчезнувший фрагмент. Таким образом, сопоставляя размеры фрагментов, выявляемых на эектрофореграммах, определяют их взаимное расположение: АВС.

20. Закон Харди—Вайнберга свидетельствует о том, что наследо­вание как таковое не меняет частоты аллелей в популяции.

Если обозначить частоту аллели А через р, а частоту аллели а через q, то при наличии по данному локусу только двух аллелей в популяции: рА + qa = 1. Соотношение генотипов в таком слу­чае будет: (рА -\- qa)² = р²АА + 2pqAa -\- q²aa= 1, в чем легко убедиться, воспользовавшись решеткой Пеннета:

Если в популяции для данного гена присутствуют три аллели с частотами р, q и г, то частоты генотипов также соответствуют формуле биномиального распределения:

(р + q + г)² = р² + q² + г² + 2pq + 2pr + 2qr = 1

и т. д. при большем числе аллелей.

Представим, что аллели А и а. встречаются с частотами 0,5, тогда в fi частоты генотипов будут:

Таким образом, 0,25АА + 0,50Ла + 0,25аа = 1. Нетрудно видеть, что при этом сохраняется исходная частота аллелей: 0,5А и 0,5а. В следующем поколении получают то же соотношение генотипов, как и в последующих поколениях. Поль­зуясь этим приемом и принимая иные значения р и q, легко убе­диться, что уже в первом поколении в популяции устанавливается равновесие, сохраняющееся и во всех последующих.

Эта закономерность была очевидна для математика X. Харди, и он хотел, чтобы она стала известна биологам, считавшим, что частота доминантной аллели в смешанной популяции может авто­матически возрастать.

В строгом смысле закон Харди — Вайнберга приложим к бесконечно большим популяциям, в которых осуществляется панмиксия и на которые не действуют никакие внешние факторы. Только при этих условиях популяция находится в равновесии, т. е. часто­ты аллелей и генотипов в ней постоянны. Очевидно, что это иде­альное представление о популяции никогда не реализуется в при­родных условиях. На популяцию постоянно действуют многочис­ленные внешние и внутренние факторы, нарушающие генетиче­ское равновесие, которые будут рассмотрены далее.

: как определить частоту аллелей в популяции при полном доминировании? Поскольку, согласно формуле Харди—Вайнберга, (рА.-}- </а)² = р²АА + 2pqAa + q²аа = 1> то, зная частоту рецес­сивных гомозигот, достаточно извлечь квадратный корень из полу­ченной величины, и мы найдем частоту рецессивной аллели q. Частота доминантной аллели составит р = 1 — q. Определив таким образом частоты аллелей А и а, можно выяснить частоты всех генотипов в популяции.

Важным следствием закона Харди—Вайнберга является то, что редкие аллели в популяции присутствуют преимущественно в ге-терозиготе. Например, если аллель а встречается с частотой 0,01, а аллель А — соответственно с частотой 0,99, то частота гетеро-зигот составит 0,0198, т. е. около 0,02, а рецессивных гомозигот — 0,0001. Таким образом, в гетерозиготном состоянии рецессивная аллель встречается более чем в 100 раз чаще, нежели в гомози-готном.