Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
С целью диагностики вирусных инфекций применяются следующие методы:
Ø Вирусоскопический – обнаружение в исследуемом материале вирусов с помощью световой (крупные вирусы, внутриклеточные включения вирусов), люминесцентной и электронной микроскопии;
Ø Вирусологический – выделение вирусов из исследуемого материала с последующей их идентификацией (установление вида и типа вируса посредством серологических реакций);
Ø Серологический – обнаружение в исследуемом материале антигенов вирусов или вирусоспецифических антител;
Ø Биологический – заражение вируссодержащим материалом лабораторных животных;
Ø Молекулярно-биологический – выявление в исследуемом материале нуклеиновых кислот вирусов (ПЦР, ДНК-зонды);
Ø Экспресс-методы – выявление антигенов вирусов в короткие сроки (РИФ);
Ø Аллергологический – выявление ГЗТ к вирусу.
Этапы вирусологического метода исследования:
1. Взятие материала (выбор материала определяется клиническими признаками заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения), транспортировка в лабораторию и подготовка к исследованию (для подавления сопутствующей бактериальной флоры обрабатывают антибиотиками).
2. Заражение исследуемым материалом чувствительной модели. Вирусы в отличии от бактерий не растут на питательных средах, т.к. являются абсолютными (облигатными) паразитами, поэтому для их культивирования применяются особые модели:
Ø в организме восприимчивых животных;
Ø в куриных эмбрионах (овокультуры);
Ø в культуре клеток.
3. Культивирование вируса в зараженной модели при стандартных условиях (оптимальная температура, продолжительность культивирования).
4. Индикация (обнаружение) вируса в зараженной модели.
5. Идентификация выделенного вируса в серологических реакциях.
Достоинство вирусологического метода – 100% достоверность.
Культивирование вирусов в организме чувствительных животных – на первом этапе развития вирусологии был единственным методом, доказывающим наличие фильтрующихся агентов в исследуемом материале.
Требования, предъявляемые к лабораторным животным:
Ø животное должно быть чувствительным к данному вирусу;
Ø использование новорожденных/молодых особей;
Ø использование инбридных (беспородных) животных/гнотобионтов (выращены в безмикробной среде);
Ø использование здоровых животных одной линии (одного пола, возраста, веса, содержащихся в одинаковых условиях).
Способ заражения животных определяется тропизмом вируса (способностью репродуцироваться в определенных типах клеток):
Ø нейротропен (например, вирус бешенства) – вводится интрацеребрально;
Ø пневмотропен (например, РС-вирусы) – интраназально;
Ø дерматропен (например, вирус натуральной оспы) – внутрикожно;
Ø пантропен – внутривенно/внутрибрюшинно.
Методы индикации вируса в организме лабораторного животного:
1) клинические симптомы заболевания;
2) гибель животного;
3) патоморфологические изменения органов при вскрытии.
Достоинства – выделение тех вирусов, которые не культивируются в куриных эмбрионах и культурах клеток.
Недостатки – контаминация животных посторонними микроорганизмами.
Культивирование вирусов методом овокультур – заражение вирусами куриных эмбрионов.
Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:
Ø должны быть из эпидемиологически благополучных хозяйств;
Ø скорлупа должна быть чистой, непигментированной, без механических повреждений;
Ø возраст – 5-12 дней (недостаточно противовирусных ингибиторов).
Способы заражения куриных эмбрионов:
Ø закрытый (прокол иглой под контролем овоскопа);
Ø открытый (с удалением части скорлупы).
Исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотические полости, хорион-аллантоисную оболочку и желточный мешок. Перед заражением скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70% этиловым спиртом и фломбируют (обжигают на пламени). После заражения отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Инкубируют при 35-370С ≈ 48 часов.
Методы индикации вируса в куриных эмбрионах:
1) результаты овоскопии – отсутствие подвижности эмбриона, слабая инъецированность сосудов кровью и отсутствие их пульсации;
2) паталогоанатомические изменения на хорион-аллантоисной оболочке – отечность, кровоизлияния, наличие оспинок (узелков);
3) отставание эмбриона в росте и развитии, пороки развития, гибель;
4) положительная реакция гемагглютинации (РГА) – через 5-10 минут при смешивании аллантоисной жидкости и суспензии эритроцитов (кур, гусей, уток, морских свинок и других животных) на дне лунки полистеролового планшета образуется осадок в виде «перевернутого зонтика» вследствие склеивания эритроцитов под действием вируса (отрицательная РГА – эритроциты не склеиваются и выпадают в осадок в виде «пуговки»).
Достоинства – высокая чувствительность к большому спектру вирусов.
Недостатки – обнаружение вируса только после вскрытия эмбриона.
Дата добавления: 2014-12-05; просмотров: 8396;