Правила приготовления питательных сред.

1. Строго соблюдать порядок внесения компонентов среды.

2. По возможности сокращать время теплообработки среды.

3. Фильтрование и корректировку рН проводить лучше до добавления агара (может измениться величина рН).

4. При корректировке рН раствором NаОН может снизится на 0,2 ед. рН. Это следует учитывать при установлении рН после стерилизации в автоклаве рН проверять вновь.

5. Углеводы следует готовить отдельно и вносить стерильно в среды перед посевом. Их внесение может привести к карамелизации и снижению рН до 5,0…6,0 ед.рН.

6. Следует учитывать изменение прозрачности гидролизатов при стерилизации и изменении рН. Это может привести к выпадению осадка.

7. Агар лучше вносить в процессе изготовления среды при нейтральном рН.

8. Иногда рекомендуется добавлять несколько больше воды, чем расчетное количество (на выкипание).

Лекция 2.2 Накопительные и чистые культуры. Рост и размножение микроорганизмов. Разнообразие типов питания. Автотрофия и гетеротрофия. Фотолитотрофия, фотоорганотрофия, хемолитотрофия

Накопительные и чистые культуры. Микробиологи для этих целей используют в качестве одного из основных - метод накопительных культур. Накопительныминазываются культуры, в которых преобладает одна группа или даже один вид микроорганизмов. Накоплениепредставляет собой основной этап процесса, который в конечном итоге позволяет получить чистые культуры. Оно также дает возможность оценить различные воздействия факторов окружающей среды на смешанную микробную популяцию, благодаря которым может происходить отбор микроорганизмов, способных взаимодействовать со специфическими субстратами или способных хорошо расти в необычных условиях. Для получения накопительных культур создают элективные условия, обеспечивающие преимущественное развитие лишь данной группы или данного вида микроорганизмов и неблагоприятные для развития сопутствующих форм микробов смешанной популяции.

Чистую культуру микроорганизма легко выделить, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой пропорции или даже преобладает количественно над другими видами, составляющими биоценоз смешанной популяции. Разработанные и используемые в микробиологии методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества особей данного организма за счет создания лучших (элективных, избирательных) условий для их роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения одного ив микроорганизмов от других членов популяции. Элективные условия предусматривают ряд факторов, влияющих на жизнедеятельность микроорганизма, например: его потребность в определенном питательном субстрате, отношение к кислороду, кислотности среды, температуре выращивания, способности к образованию спор и т.д. О развитии накопительной культуры судят визуально по характерным признакам изменения питательной среды, образованию пленки, выделению пигмента, появлению мути, возникновению пузырьков газа, а также по микроскопии микроорганизма на прижизненных и постоянных микробиологических препаратах.

На основе накопительных культур далее выделяют чистые культуры микроорганизмов.

Получение накопительных культур различных таксономических групп проводят при использовании физических, химических и биологических методов.

К физическим методам,которые могут быть использованы для получения накопительных культур, следует отнести: регуляцию роста температурой, тепловое одномоментное воздействие, ультразвуковую обработку и ультрафиолетовое облучение, приводящих избирательно к гибели или подавлению роста других микроорганизмов, присутствующих в популяции. Можно также использовать преимущества изучаемого микроорганизма в некоторых физических свойствах, таких, как его размеры и подвижность.

В химических методахиспользуют токсичные вещества, антибиотики, химиопрепараты, которые подавляют рост или убивают большинство микробов, находящихся в исследуемой популяции, не оказывая существенного влияния на выделяемый микроорганизм.

Биологические методывключают использование специфических чувствительных хозяев (животных), которые служат биофильтром для всей исследуемой популяции микроорганизмов. Данный способ используют в большей степени при работе с патогенными микроорганизмами, которые за счет своих свойств (инвазивность, токсигенность и др.) получают преимущества при развитии в организме чувствительных животных.

Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления используют сочетания физических, химических и биологических методов.

Чистая культура. Чистой (аксенической) культурой микроорганизмов называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида.Умение выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популяции, существующей в природе, и поддерживать чистоту культуры - необходимое условие работы с микроорганизмами. Процесс выделения чистой культуры из смешанной обычно включает предварительный этап получения накопительной культуры (будет рассмотрен отдельно), этап собственно выделения чистой культуры и последующий этап контроля и поддержания чистоты и идентификации микроорганизма.

В соответствии о биологическими понятиями о виде как основной таксономической единице в микробиологии, вид определяется как эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическим и другими признаками.Однако генетические механизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность перечисленных признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (типах) микроорганизмов, отличающихся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают морфологические (морфовары), биологические (биовары), ферментативные (ферментовары), резистентные к антибиотикам (резистеновары) и бактериофагам (фаговары) варианты бактерий. Наряду с этим, отдельные виды могут включать варианты, различающиеся по антигенной структуре (серовары), экологическим нишам, в которых они обитают (эковары) и патогенности для определенных хозяев (патовары).

Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды - в семейства, семейства - в порядки.

Для названия микроорганизмов используется биноминальная номенклатура, согласно которой первое слово обозначает род. Оно пишется с прописной буквы. Второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. Обычно название рода основано на морфологическом признаке соответствующих микробов (например, Staphylococcus, Vibrio, Corynebakterium), либо является производным от фамилии автора, который открыл или изучил данный микроорганизм (например, Neissеria, Shigella, Escherichia, Ricketsia)..Видовое название часто связано с источником происхождения (например, E.coli - кишечная палочка) или наименованием (проявлением) заболевания (например, S.dusenteriae - дизентерия).

В микробиологии широко применяется ряд специальных понятий и терминов. Штамм - более узкое понятие, чем вид. Штаммом называют культуру микробов, выделенную из определенного источника(организма человека, животного, окружающей среды). Обычно штаммы обозначают протокольными номерами (или номерами соответствующей коллекции микроорганизмов, либо называют по местности, где он был выделен (например, вирус гриппа Гонконг, Сингапур), либо по источнику выделения (например, водный, кишечный). Штаммы одного и того же вида могут быть совершенно идентичными или различаются по некоторым признакам, не выходящим за пределы характеристики вида.

Термином клон обозначают культуру микроорганизмов, полученную от одной особи микробной клетки(одноклеточная культура). Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида (штамма или клона), выращенные на питательной среде.

Обычно в практике микробиологических лабораторий для установления принадлежности, выделенной чистой культуры к определенному виду определяют ее основные свойства (признаки): культурально-морфологические (характер роста на жидких и плотных питательных средах), тинкториальные (отношение к красителям), биохимические (ферментация сахаров, спиртов, образование индола, сероводорода и др.) и антигенные.

Методы выделения чистых культур.Для выделения чистых культур микробов ив материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.

Очень часто применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору внешней среды была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высоких температур.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроорганизмов, который предполагается выделить из исследуемого материала.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху).Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонного агара, ставят в водяную- баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43-45°С. В пробирку вносят бактериологической петлей исследуемый материал и среду перемешивают (встряхивают ударами о ладонь). Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку интенсивно вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое первой пробирки переносят во вторую, таким же образом - из второй в третью. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После остывания и застудневания (уплотнения) среды с исследуемым материалом в чашках Петри их помещают в термостат. Количество выросших колоний в чашках Петри с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.