Цианметгемоглобин әдісі.

Гематологияда, референт ретінде қалыптандыру Халықаралық комитетінің ұсынған әдісі. Цианметгемоглобиндік әдіс дәлме-дәлдігімен, қарапайымдылығымен, арзан және гематологиялық жіктегіштердің қолдану ыңғайлылығымен сипатталады. Оның жоғары дәлме-дәлдігі гемоглобиннің барлық түрлері тасымалдаушы ерітіндінің қатысуымен цианметгемоглобинге ауысып, сонымен бірге ерітіндінің оптикалық қысымы Бугер-Ламберт-Бер заңына бағынады.

Гемиглобинцианид сақтауға өте тұрақты және қолайлы. Оның миллимолекулярлық экстинциясы белгілі (11,0 л/моль х см).

Шарты: қанға реагент қосылғанда гемоглобин цианметгемоглобинге айналады. Цианметгемоглобиннің мөлшері фотометрия арқылы тіркеледі.

Теміркөк калий әсерінен гемоглобин метагемоглобинге дейін қышқылданады, кейіннен калий цианин көмегімен цианметгемоглобинге айналады..

Керекті жабдықтар мен реактивтер:

- Фотоколориметр;

- Драбкин (тасымалдаушы) ерітіндісі (NaHCO -1 г, KCN - 0.05 г, K[Fe(CN)] – 0.2 г;

- 1 литр залалсыздандырған су.

Анықтау жүрісі. Пробиркаға 5 мл тасымалдаушы ерітінді құйылады, оған 20 мкл қан қосылады (қатынасы 1:251). Қоспаны араластырған соң 10 минуттан кейін (осы уақытта гемоглобин гемоглобинцианидке айналады) экстинкция тіркеледі: толқынның ұзындығы 540 нм, қабаттың қалыңдығы 1см, суға қарама қарсы. Жұмыс кезінде 1,5 мл, 3 мл және 4,5 мл пластик кюветтерді қолдануға болады.

Фотометрде 540 нм немесе ФЭК – 520-560 нм толқын ұзындығында (жасыл сәуле фильтрі), жол ұзындығы 10мм кюветте, тасымалдаушы ерітіндіге (бақылау) қарама қарсы анықтау жұмысы жүргізіледі.

Гемиглобинцианид жағдайы белгілі көлемде және 367,7 ( g = 570 нм ) тең. Оны мына формуламен шығаруға болады:

А [540НіСN] х 16114,5 х 10 х Р

Hb (г/л) = -------------------------------------------- = 367.7 x А [540НіСN]; сонда

11,0 х L

А [540НіСN] – 540 нм толқын ұзындығында гемоглобин ерітіндісінің сорылуы;

16114,5 гемоглобин мономердің молекулярлық массасы;

L – оптикалық жолдың ұзындығы, көптеген фотометрлерде 10мм тең;

10 – гемоглобиннің молекулярлық массасын миллимолекулярлы массаға ауыстыру;

Р – қанның сұйылуы (1:251, қан 20 мкл және 5,0 мл тасымалдаушы ерітіндінің қатынасы).

Қазіргі кезде цианиометгемоглобин қалыпты түрде шығарылады, ол гемоглобиннің концентрациясын дәлме-дәл анықтауға қолданылады. Нәтижені калибр қисықты сызумен анықталады. Миллиметрлік қағазға ұзынынан абцисс сызығының паспортында көрсетілген гемоглобиннің концентрациясы г/л (ампуладағы гемиглобинцианид мөлшеріне сәйкес) сызылады. Көлденең – ординатта – гемиглобинцианид ерітіндісінің абсорбциялық мөлшері немесе гемоглобинометрдің көрсеткіші жасалады. Калибрлі график координаттың басынан сызылған тік сызық болуы керек. Егерде сызык тік болмаса, онда қателік жіберілгенінің немесе жабдық бұзылғанының көрсеткіші. Әр фотометрдің өзіне тән сызығы жасалады. Калибрлі сызық бойынша формула шығарылады

Патологиялық жағдайлар кезіндегі гемоглобиннің өзгерістері.

Гемоглобинопатиялар (гемоглобиноздар) гемоглобиннің нәруызды бөліктердің тұқым қуалайтын бұзылыстарына байланысты.

Орақ тәрізді жасушалық қан аздық – гемоглобинопатияның түрі. Молекулярлы деңгейде, гемоглобин шынжырларының жинақталуын бақылайтын гендер құрылысының мутациясынан глутамин аминқышқылдары валин аминқышқылдарына ауысады. Бұл патологияда қанның ерекше қасиеті - эритроциттер қоршаған ортасында оттегінің тиісті қысымдылығының төмендігінен орақ тәрізді болады.

Орақ тәрізді эритроциттерді анықтауға арнайы сынама қолданады – ол үшін вена қанын гипоксияға ұщыратады.

Анықтау жүрісі. 5 минутқа қолдың саусағын байлап, қан алынады қанға метабиосульфат жүрісі натрий қосылады, сонда орақ тәрізді эритроциттер пайда болады.

Түсті көрсеткіш.

Түсті көрсеткіш (ТК) эритроциттегі гемоглобиннің салыстырмалы мөлшерін көрсетеді, клиникалық МСН сәйкес және МСV түзуге қатысады. Түстік көрсеткіштің мөлшеріне қарай гипо- (ТК < 0,8), қалыпты -(ТК = 0,85-1,05) және гиперхромды (ТК > 1,1) деп бөледі.

ТК формуламен есептелінеді:

Hb сынау RBC сынау

ТК = ---------------------:----------------------, сондағы

Hb қалыпты RBC қалыпты

Hb бақылау - зерттелген қандағы гемоглобиннің мөлшері

Hb қалыпты – гемоглобиннің қалыпты көрсеткіші (1л қанның Hb қалыпты көрсеткіші ескеріледі).

RBC бақылау – зерттелген қандағы эритроциттердің саны

RBC қалыпты - эритроциттердің қалыпты көрсеткіші ( 1л қанның Э қалыпты саны ескеріледі).

Барлығын қысқартқаннан кейін

3 х Hb

ТК = -------------------------------------------

RBC cынау (бірінші үш саны)

ТК қалыпты көрсеткіші 0,86 – 1,05 тең.

Сенімді және дәлме-дәл әдістерге эритроциттердің орташа аумағының анықталуы (MCV) – гематокриттің көлемі 1мм қандағы эритроциттердің санына бөлінеді. Нәтижесі ку/микронда (мкм) немесе фемтолитрда (фл) белгіленеді.

Гематокрит () х 10

MCV = ---------------------------------------------------------;

Эритроциттердің саны (млн.кл/мм)

МCV нақты көрсеткіші, себебі эритроциттердің диаметрін анықтағанда эритроциттердің морфологиясында өзгерістер болады:

· жағынды кеуіп қалғанда эритроциттердің диаметрі 10-20% -ға кішірейеді

· қалың жағындыда эритроциттердің диаметрі кіші

· жағындыда ұзыннан жатқан эритроциттердің диаметрі үлкендеу.

Қалыпты көрсеткіші – 80-95 фл (мкм). Адамның өмірінде MCV көрсеткіші бірнеше рет өзгерістерге ұшырайды: нәрестелерде 128фл-ге дейін жетеді, өмірінің бірінші аптасында 100-112фл дейін төмендейді, алты айлығында 78фл түседі, бір жаста 77-78фл тең, 4-5 жаста төменгі көрсеткіші (80фл) тұрақталады. MCV 80фл дейін төмендесе – микроцитоздың, 95фл көтерілсе – макроцитоздың белгісі.

Эритроциттегі гемоглобиннің мөлшері (MCН) формуламен есептеледі

Гемоглобин (г/л)

МСН = -----------------------------------------

Эритроциттердің саны (млн/л)

Нәтижесі пикограммен (пг) белгіленеді, қалыпты көрсеткіші 27-31пг. Бұл көрсеткіш әр эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің орташа мөлшерін көрсетеді. Ол ТК ұқсас. Осы индекстер бойынша қан аздығы қалыпты-, гипо-, гиперхромды түрлеріне бөлінеді.

Эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің орташа мөлшері (МСНС) – гемоглобиннің мөлшері г/100 бөлінеді гематокрит көрсеткішіне және 100 көбейтіледі.

Гемоглобин (г/дл)

МСНС = ----------------------------- х 100 (г/дл)

Гематокрит (%)

Екі индекстің айырмашылығы: МСН бір эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің көлемін көрсетеді және пикограммен белгіленеді. МСНС эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің концентрациясының көрсеткіші, ол гемоглобиннің қарқындылығын көрсетеді, қалыпты жағдайда 30-38г/дл тең. МСНС, МСН салыстырғанда, өте сезімтал сынама гемоглобиннің түзілуінің бұзылғанын көрсетеді. Гемоглобиннің шекті концентрациясы (38 г/дл) сирек кездесетін жағдай. Оның жоғарылауы гемоглобиннің кристалдарға айналуымен және эритроциттердің гемолизге ұшырауымен аяқталады.

Эритроциттердің осмостық тұрақтылығын анықтау

Осмостық тұрақтылық – эритроциттер гипотониялық тұздардың ерітінділеріне тұрақтылығы. Осмостық қысымдылығы, қанның осмостық қысымдылығына тең ерітінділерде эритроциттер өзгермейді. Тұзды ерітінділердің осмостық қысымдылығы мен қанның осмостық қысымдылығына тең болса, ондай ерітінділер изотониялық деп аталады. Изотониялық ерітінділерге 0,85-0,9%-дық натрий хлоридінің ерітіндісі жатады. Эритроциттер 0,85% концентрациядан төмен – гипотониялық ерітіндіге салынса олар ісініп, жарылады (гемолиз). Гипертониялық ерітінділерде эритроциттер жиырылады, себебі ішіндегі сулар үлкен осмостық қысымдылықпен ерітіндіге шығады. Эритроциттердің осы қасиетіне осмостық тұрақтылықтың анықталуы негізделген.

Эритроциттердің физикалық және химиялық қасиеттерін бағалау үшін Л.И.Идельсон (1974) модификациясы қолданылады.

Шарты. Эритроциттердің санды гемолиз дәрежесін буферлі натрий хлоридін гипотониялық ерітінділерде анықтау.

Реактивтер. Негізгі ерітінді (осмостық концентрациясы 10% натрий хлорид ерітіндісіне сәйкес), рН ортасы 7,4. Құрамы: екі орнын басқан натрий фосфаты (Nа2НРО4) – 27,31 г (немесе Na2НРО4 х Н2О – 34,23г), бір орнын басқан натрий фосфаты (NаН2РО4 х Н2О) – 4,86, натрий хлориді – 180г, залалсыздандырылған су – 2 литрге дейін. Ерітіндіні жабық ыдыста, мұздатқышта бірнеше айға дейін сақтауға болады.

1% натрий хлорид жұмыс ерітіндісін дайындауға, негізгі ерітінді 10 есе сүйылтылады. 1% натрий хлорид ерітіндісінен келесі концентрациялар дайындалады: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20; 0,10. Бұл ерітінділерді 100 мл дайындап, мұздатқышта 2 аптаға дейін сақтауға болады.

Анықтау жүрісі. Екі залалсыздандырылған пробиркаға 2 тамшыдан гепарин және 1,5мл қан құйылады. Араластырып, бір пробирканы зерттеуге жұмсалады, екіншісі – термостатқа бір тәулікке қойылады. Штативке қойылған және концентрациялары жазылған, 14 центрифугалық пробиркалар қойылады. Әр пробиркаға 5,0 мл 1 - 10% натрий хлорид ертіндісі құйылады және оларға 0,02 мл Сали пипеткасымен гепаринді қан қосылады. Араластырып, 30 минутқа бөлме температурасында қалдырылады. Пробиркадағы қоспалар, центрифугада 2000 айналым/мин 5 минут айналдырылған соң, үстіңгі сұйықты төгіп, фотоколориметрде толқынның ұзындығы 500-560 нм (жасыл сәулефильтр), кюветтің қалыңдығы 10мм, бақалауға қарама-қарсы қойылып анықталады. Бақылау сынамасы – 1% натрий хлорид ерітіндісі.

Есептеу. 100% гемолиз – егерде пробиркадағы 0,1% буфер ерітіндісінде гемолиз болса. Әр пробиркадағы гемолиздің жеке пайызы есептеледі, үстіңгі сұйықтың экстинциясы 100% алынған экстинсиямен салыстырып, формуламен шығарылады:

Ех Х 100

% Гемолизі = ---------------------------------, сонда

Е1

Е1 – пробиркадағы 0,1 натрий хлорид ерітіндінің үстіңгі сұйықтың экстинциясы

Ех – зерттелетін сынамының экстинциясы

100 – 0,1 натрий хлорид ертіндісімен пробиркадағы гемолиздің пайызы.

Келесі күні, 24 сағатқа қалдырылған қанның зерттеуін қайталау керек, себебі кейбір кезде эритроциттердің осмостық тұрақтылықтың төмендеуі термостатта тұрған қанда анықталады.

Қалыпты көрсеткіші. Сау адамда жаңадан алынған қанда гемолиз 0,50-0,45% натрий хлорид ертіндісінде байқалады, толық гемолиз – 0,40-0,35% NaCI концентрациясында тіркеледі.

Клиникалық маңыздылығы. Зерттеу гемолиздік қан аздығына күдіктенген кезінде өткізіледі. Осмостық тұрақтылықтың төмендеуі, яғни эритроциттердің натрий хлорид ерітіндісінің 0,70-0,75% концентрациясында гемолиз пайда болса, ол тұқым қуалайтын микросфероциттік және кейбір тұқым қуалайтын сфероциттік емес гемолитикалық қан аздықтарында, сонымен бірге кейбір кезде аутоиммундық гемолиздік қан аздықтарында байқалады. Осмостық тұрақтылықтың жоғарлауы талассемияға, гемоглобинпатияға тән

Гематокритті анықтау.

Алдын ала антикоагулянтпен өңделген және кептірілген капилляр 7/8 ұзындығы зерттелетін қанмен толтырылады. Капиллярдың бір ұшы арнайы сағызбен жабылады. Сонан соң центрифуганың роторына салынады. Салынған кезде капиллярдың жабылған ұшы резинкалық табанға тіреліп тұруы керек. Центрифугада 11000 д (8000 айналым/мин.) 5 минут айналады. Гематокрит көлемі қызыл қанның мөлшері бойынша тіркеледі.

Гематокрит мөлшерін анықтауға коммерциялық гепаринді және гепаринсіз гематокрит стандартты 75мм, 70мм және 30мм капилярлары (Deltalab) қолданылады.

Антикоагулянттар: гепарин 5000ЕД/мл дистилденген сумен 1:5 сұйылтады немесе К2-ЭДТА (трилон Б) – 40 г/л.

Ретикулоциттерді анықтау.

Ретикулоциттерді бриллианттық крезил көкпен, азур І немесе азур ІІ боялғаннан соң есептеу әдісі.

Шарты. Ретикулоциттердің дәнекті-жіпшік субстанциясын анықтауға суправитальді бояғыштармен бояу.

Келесі бояғыштарды қолдануға болады:

1. Абсолюттік спиртте ерітілген қанық бриллианттық крезил көк ерітіндісін

(абсолюттік спиртті дайындау: 96% этанолға бірнеше рет ауыстырып қыздырған мыс купоросында ұстау керек). 100 мл абсолюттік спиртке+1,2г бояу.

2. Азур І ерітіндісі. Азур І – 1г, аммоний оксалаты – 0,4г, натрий хлориді – 0,6-8г, 96 этил спирті – 10 мл, залалсыздандырылған су – 90 мл. Ерітінді тығынмен жабылған ыдысқа құйылып, 2-3 күн 37⁰С термостатта ұсталып, арасында шайқап тұру қажет, сонан соң бөлме температурасына дейін суытып, қағаз фильтрден өткізіледі. Дайын ерітінді күңгүрт ыдыста сақталады. Бояудың тұнбасы пайда болса, қайтадан сүзіп алынады.

3. Азур ІІ ерітіндісі. Азур ІІ – 1г, натрий цитраты – 5г, натрий хлориді – 0,4г, залалсыздандырылған су – 45 мл. Ерітінді термостатта 37⁰С екі тәулікке қалдырылады, арасында шайқалып тұру қажет. Бояу тез еру үшін, әлсіз отқа 15-20 минут, қайнатпай, қыздырып алуға болады. Бөлме температурасына дейін суытып, сүзіледі. Күңгірт ыдыста сақталады.

Әйнекте бояу. Таза, майсыздандырылған жағынды әйнекті спирт отына жылытып, үстіне әйнекті таяқшамен бір тамшы бояу тамызылады және қырнақталған әйнекпен бояуды жағады. Бояу жағылған жағынды әйнектің үсті белгіленеді. Осы әдіспен көп бояудың жағындысы жасалып қойылады, құрғақ, қараңғы жерде сақталады. Зерттеу алдында дайын бояу жағындының үстіне бір тамшы зерттелетін қанды тамызып, жұқа жағынды жасалады. Ол ылғал камераға 3-4 минутқа салынады, сонан соң ауаға кептіріп, микроскоппен иммерсия жүйесінде зерттеледі. Жағындыда эритроциттер сары-жасыл түсті, дәнекті-жіпшік субстанциясы – көк түсті.

Пробиркада бояу.

1 әдіс – жұмыс алдынды бриллианттық крезил көк ерітіндісі дайындалады – 1 тамшы 1% калий оксалат ерітіндісіне + 4 тамшы бояу №1. Қоспаның үстіне 0,04 мл зерттелетін қан қосылады ( 0,02 мл Сали пипеткасымен екі рет ), жақсылап араластырған соң, 30 минутқа қалдырылады. Араластырып, жұқа жағынды жасалады.

2 әдіс – пробиркаға 0,05 мл №3 бояу құйылады + 0,2 мл қан қосылады. Қоспаны араластырып, 20-30 минутқа қалдырылады. Араластырып, жұқа жағынды жасалады.

3 әдіс – пробиркаға 0,3-0,5 мл №2 бояу ерітіндісі құйылады + 5-6 тамшы Сали пипеткасымен қан қосылады. Пробирканы резиналық тығынмен жауып, араластырып,

1-1,5 сағатқа қалдырылады. Араластырған соң, жұқа жағынды жасалады.

Жағындыда эритроциттер сарғыш-жасыл түсті, дәнекті-жіпшік субстанциясы – көк немесе көкшіл-күлгін түсті. Ретикулоциттер 1000 эритроциттердің арасында есептеледі, пайыз (%) немесе промил (%о) белгісі қойлады.

Қазіргі кезде ретикулоциттерді бояуға дайын жиынтықтар қолданылады («Гем» фирмасы), «Диахим-Гемистейн-РТЦ» НПФ «Абрикос+» (С-Петербург).

Ретикулоциттерді қосымша блоктармен қамсыздандырған гематологиялық талдаушыда анықтауға болады. Бұл талдаушы салыстырмалы (%) және абсолюттік санын (#), ретикулоциттердің жетілу индексін, ретикулоциттердің орташа аумағын анықтайды. Сонымен бірге, ретикулоциттерді 3 сыныпқа бөлуін (РНҚ құрамдас болуын) атқарады. Ретикулоциттердің санын есептеу және оның жетілу дәрежесін бағалау эритропоэздің түрлі гематологиялық ауруларына сипаттама беруге көмектеседі.

Клиникалық маңызы: гематологиялық қан аздықтарында ретикулоциттердің саны өседі, сонымен бірге бұл жағдай пароксизмалді түнгі гемоглобинурияда, эритроцитоз кезінде байқалады. Төмендеуі: апластикалық қан аздығында және жедел миелолейкозда болады. Жоғарлаған РНҚ мен жас ретикулоциттер гемолитикалық қан аздығында және жедел лейкоздарда кездеседі.