Культивирование микроорганизмов.

В мире существует два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).

Периодическое (статическое) культивирование

Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов метаболизма, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве).

Сл. 8. Изменение численности популяции клеток при периодическом культивировании имеет определенную закономерность. Если по оси абсцисс отложить время, а по оси ординат – логарифм числа жизнеспособных клеток, то можно построить кривую роста бактерий. Типичная кривая роста имеет S- образную форму. Анализируя кривую можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:

Начальную или лаг-фазу;

Экспоненциальную или логарифмическую фазу;

Стационарную фазу;

Фазу отмирания.

Кривая роста бактериальной культуры:

1) лаг-фаза; 2) экспоненциальная фаза;

3) стационарная фаза; 4) фаза отмирания.

Лаг-фаза включает период от посева бактерий на свежую питательную среду до достижения ими максимальной скорости роста. В начале лаг-фазы бактерии приспосабливаются к новым условиям. В клетках идет синтез ферментов, нуклеиновых кислот, белков, активируются обменные процессы. Клетки интенсивно растут, и размеры их заметно увеличиваются. Деления бактерий на этой стадии практически не происходит. Длительность этой фазы зависит от полноценности питательной среды и от состояния культуры микроорганизма. Чем полноценнее питательная среда и чем моложе культура бактерий, тем короче лаг-фаза.

Экспоненциальная фаза характеризуется активным делением подавляющей массы клеток бактериальной популяции. Число клеток возрастает в геометрической прогрессии. Характеризуется постоянной максимальной скоростью или скоростью роста. Эта скорость зависит от вида бактерий. Бактерии E. coli при 37⁰С делятся каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter – 5-10 часов.

Во время этой фазы клетки имеют приблизительно равный размер, содержание белка в них тоже постоянно. Клетки содержат максимальное количество РНК. Клетки на этой фазе наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число живых клеток достигает максимума и перестает увеличиваться, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. Так как скорость роста зависит от концентрации субстрата, то при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления О₂ или накопления токсичных продуктов обмена. Клетоки по химическому составу отличается от состава клеток в экспоненциальной фазе. Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к физическим воздействиям и химическим агентам, чем в экспоненциальной фазе роста культур. В этот период в клетках и в среде нередко накапливаются продукты вторичного метаболизма (антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.). Продолжительность этой фазы от нескольких часов до недели в зависимости от вида микроорганизмов.

В стационарную фазу роста поведение клеток бактериальной популяции регулирует такое явление как апоптоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, а клетки другой субпопуляции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться.

В фазе отмиранияпроисходит снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий широко варьирует в за­висимости от условий и особенностей организма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от некоторых видов бактерий рода Bacillus, которые отмирают быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными. Это и накопление органических кислот (как у бактерий родов Escherichia. Lactobacillus), автолиз (лизис под дейст­вием собственных ферментов), накопление антибиотиков, бактериоцинов и другие причины. Сл. 9

Непрерывное проточное культивирование заключается в том, что в сосуд, содержащий популяцию бактерий, периодически подается свежая питательная среда и одновременно удаляется из него избыток среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет задержать культуру в состоянии экспоненциального роста.

Проточное культивирование осуществляется в аппаратах двух типов: хемостатах и турбидостатах.

В хемостатах рост бактериальной популяции контролируется концентрацией питательного субстрата по источнику углерода и азота. Для равномерного распределения питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Излишняя микробная масса с питательной средой через сливной сифон вытекает из культиватора.

Турбидостат – это тот же хемостат, но снабженный фотоэлекрическим элементом, регистрирующим мутность среды. Когда плотность биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, фотоэлемент, соединенный системой реле, подает свежую питательную среду.

Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы или ферментеры. Ферментерыпредставляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальную рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается.

Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии. Кроме того, оно используется при проведении физиологических, биохимических, генетических исследований, так как при данном культивировании поддерживается постоянство плотности популяции и концентрации всех компонентов питательной среды.

Однако, часто для изучения процессов обмена веществ необходимо, чтобы все клетки суспензии делились одновременно (синхронно). Культуры. в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называются синхронными. Синхронизировать деление какой-нибудь популяции можно с помощью различных искусственных приемов, таких как изменение температуры, воздействие света (для фототрофных микроорганизмов), ограничение количеств питательных веществ или пропускание микроорганизмов через специальный фильтр, чтобы получить клетки одного размера. Но синхронизированная культура после 2-3 генераций переходит к асинхронному делению.

Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии, а именно в производстве ценных органических веществ, в деградации вредных производственных соединений и промышленных отходов с целью очистки сточных вод от загрязнений.

Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют химические, механические и физические методы иммобилизации микроорганизмов.

Химический способ заключается в образовании ковалентной связи между какой-то из функциональных групп на поверхности клетки и носителем. Этот метод применяется редко, так как клетки в этом состоянии могут терять активность.

Механический метод основан на полимеризации какого-либо мономера, смешанного с суспензией бактерий. В результате микроорганизм оказывается заключенным в ячейку, которая ограничивает его перемещение. но не препятствует поступлению питательных веществ. Чаще всего в виде носителя используется ПААГ полиакриламидного геля. В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, козеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают субстрат.

Сл. 10. Физический метод иммобилизации заключается в адсорбции микроорганизмов на поверхности различных синтетических пористых материалов.

Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом также облегчается выделение продуктов биосинтеза.