Лигирование по одноименным "липким" концам с обработкой щелочной фосфатазой

При лигировании двух фрагментов ДНК, один из которых является линеаризованным вектором (см. раздел векторы), а другой – донорной ДНК, содержащей нужный фрагмент ДНК и предварительно обработанной такой же эндонуклеазой как и вектор, целесообразно применить еще один фермент-инструмент: щелочную фосфатазу. Чтобы предупредить комплементарное взаимодействие между липкими концами одного и того же типа рестрицированных фрагментов, например – линеаризованного вектора, проводят обработку фосфатазой, которая отщепляет фосфатные группы на 5’-концах одноцепочечных липких концов. ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной векторной ДНК (рис. 14).

 

Рис. 14 . Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор.

Плазмидную ДНК, обработанную эндонуклеазой рестрикции и щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям

 

Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК (рис. 14). При репликации этой ДНК после введения ее в клетку-реципиент одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.

 








Дата добавления: 2015-07-14; просмотров: 1245;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.003 сек.