РАЗДЕЛЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Раздел 2 "Культивирование животных клеток и тканей"

Цели и задачи, введение в культуру, особенности питательных сред и режима выращивания. Получение и использование культур клеток человека. Основные способы культивирования животных клеток. Культуры животных тканей и особенности культивирования органов. Гибридизация животных клеток. Методы получения моноклональных антител. Иммуноферментный анализ (ИФА). Получение химер. Клонирование животных. Культивирование органов.

Существенную роль играет использование клеток животных, например, для культивирования вирусов, при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител клетками гибридом.

С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивается в культурах клеток млекопитающих. С тех пор линии культур клеток человека стали незаменимыми для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (таких, как антитела и интерфероны), в исследованиях рака и в противовирусной химиотерапии.

Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным ферментом, трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с культуральной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель— микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферирируют. Деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки, тогда как клетки дрожжей делятся каждые 1,5—2 ч, а бактериальные клетки — каждые 20— 60 мин.

Клетки нуждаются в многочисленных питательных веществах, поэтому в культуральную среду необходимо добавлять смесь аминокислот, пуринов и пиримидинов для синтеза белков и нуклеиновых кислот, глюкозу в качестве источника углерода и энергии, витамины и минеральные соли для поддержания необходимого осмотического давления и значения рН, близкого к 7,2. Среда содержит небольшие концентрации антибиотиков для подавления роста бактерий и 5-20% сыворотки крови. Для оптимального роста температура культуры необходимо поддерживать около 37 оС; ниже 36 клетки делятся кране медленно, либо не делятся вовсе, а при температуре выше 38 погибают. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при -180° С.

Раздел 3 "Культуры растительных клеток"

Культура клеток высших растений. История развития метода. Применение культуры клеток высших растений. Введение клеток в культуру. Морфофизиологическая характеристика каллуса, методы изучения роста клеточных культур. Суспензионные культуры. Особенности культивирования отдельных клеток.

Способы получения и слияния растительных протопластов. Протопласты растительных клеток в биотехнологии растений. Парасексуальная гибридизация и виды соматических гибридов, их жизнеспособность. Введение органелл в изолированные протопласты - биологическое конструирование клеток. Культуры гаплоидных клеток, способы получения, значение. Использование культур растительных клеток в генетике и селекции.

Создание искусственных ассоциаций культивируемых клеток высших растений с микроорганизмами. Цианобактерии в искусственных ассоциациях. Бесклеточные белок синтезирующие системы.

Микроклональное размножение, его достоинства и недостатки, методы микроклонального размножения растений. Получение безвирусных растений - хемотерапия, термотерапия. Криоконсервация культивируемых клеток растений и животных как метод сохранения генофонда. Способы замедления роста. Иммобилизация растительных клеток.

Развитие биотехнологии коснулось и растений, хотя и позднее: для широкомасштабного производства клонов растений используются меристемы, а культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ, как самых обычных (алкалоиды и другие вторичные метаболиты), так и экзотических (идиолиты).

В 1937 г. Готере с успехом культивировал недифференцированную ткань моркови. Такие культуры можно было поддерживать неопределенно долго. Некоторые линии, полученные Готере, поддерживаются в культуре до сих пор.

В 1957 г. Скоог и Миллер, обработав каллус растительными гормонами (ауксином и кинетином), добились образования корней и стеблей. Затем Морель показал, что другой растительный гормон — гиббереллин — индуцирует пролиферацию меристем и их дифференцировку с образованием, в конечном счете, целого растения. Этот процесс регенерации нашел важное применение в сельскохозяйственной практике— на нем основано получение безвирусных растений, а также размножение новых культурных разновидностей или видов, которые обычно не размножаются вегетативно.

Биологическое многообразие культур растительных клеток и тканей открывает интересные перспективы изучения новых полезных соединений. Начиная с 1970 г. исследователи нередко наблюдали, что клетки, растущие в культуре, синтезируют вещества, которые не обнаруживаются в целом растении. Так, клеточные культуры Catharanthus roscus синтезируют несколько десятков различных алкалоидов; из них идентифицированы лишь восемь, четыре не найдены в целом растении, а два оказались неизвестными дотоле веществами.

Раздел 4 "Генная инженерия" (Биоинженерия)

●Биоинженерия или биомедицинская инженерия — это дисциплина, направленная на углубление знаний в области инженерии, биологии и медицины и укрепление здоровья человечества за счет междисциплинарных разработок, которые объединяют в себе инженерные подходы с достижениями биомедицинской науки и клинической практики. Биоинженерия/биомедицинская инженерия — это применение технических подходов для решения медицинских проблем в целях улучшения охраны здоровья.

Введение. История развития генной инженерии. Молекулярные основы генной инженерии. Методы технологии рекомбинантых ДНК. Основные ферменты рестрикции. Построение рестрикционных карт и способы определения нуклеотидной последовательности.

Конструирование рекомбинантных ДНК и их клонирование. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Способы введения гена в клетку. Типы векторов. Гены-маркеры, селективные и репортерные гены. Требования к векторной ДНК, ее состав, экспрессия генов.

Генетическая инженерия микроорганизмов. Генетические манипуляции с клетками млекопитающих. Создание трансгенных животных. Генотерапия. Генная инженерия растений. Достижения генной инженерии и проблемы биобезопасности трансгенных организмов.

Совершенствование процессов сбраживания, увеличение их эффективности, а также изучение многочисленных биохимических реакций, присущих микроорганизмам, шли параллельно с выделением из клеток бактерий и грибов веществ, которые все в большей степени вытесняли синтетические продукты.

Что касается более современных биотехнологических процессов, то они основаны на методах рекомбинантных ДНК, а также на использовании иммобилизованных ферментов, клеток или клеточных органелл.

При их рассмотрении предпочтительнее пользоваться терминами «генетическая рекомбинация in vitro» или «использование рекомбинантных ДНК», а не «манипулирование генами» или «генная инженерия». Согласно определению Национальных институтов здоровья США, рекомбинантными ДНК называются молекулы ДНК, полученные вне живой клетки, в пробирке, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке. Основу эксперимента составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который представляет собой бактериальную плазмиду или геном вируса; затем рекомбинантную молекулу ДНК вводят в клетку, где она реплицируется. Клетка, содержащая такую ДНК, размножается, образуя клон трансформированных клеток. Одна из целей биотехнологии заключается в том, чтобы получить клоны трансформированных клеток, способных к экспрессии чужеродной генетической информации и образованию специфических белков в больших количествах.

Предпосылкой прогресса в этой области послужило открытие в 1972 г. Арбером (Базель) и Смитом и Натансом (Университет Джона Гопкинса) — лауреатами Нобелевской премии 1978 г.— ферментов рестрикции, которые расщепляют ДНК в специфических участках. Не менее важным оказалось открытие лигаз — ферментов, способных «сшивать» фрагменты ДНК,— и обратной транскриптазы, синтезирующей ДНК на матрице РНК. Для встраивания одного или нескольких генов в ДНК с последующим введением в клетки микроорганизма необходимы как рестрикционные эндонуклеазы, так и лигазы.

Следует подчеркнуть, что генная инженерия чрезвычайно важна не только для биотехнологических разработок, но в не меньшей степени и для фундаментальных исследований, связанных с изучением структуры генов высших организмов, регуляции экспрессии генов, структуры белков, которую определяют по структуре кодирующей их ДНК, а также перетасовки генов в эволюции.

Технология иммобилизованных ферментов получила свое развитие в конце 60-х гг. (по этому методы ферменты связывают с пористым гелем или фиксируют на поверхности твердой подложки) и с успехом применялась не только в промышленном производстве полусинтетических пенициллинов, получении концентрата фруктозы из крахмала зерновых культур, но и при проведении биохимических анализов. Еще эффективнее оказываются иммобилизованные клетки или клеточные органеллы, поскольку они содержат все необходимые гены для синтеза сложных соединений.

Таким образом, развитие биотехнологии в огромной степени определяется исследованиями в области микробиологии, биохимии, энзимологии и генетики микроорганизмов, а также наличием коллекций культур микроорганизмов, надлежащим образом учтенных и постоянно изучаемых. Необходимо уделять внимание и таксономии микроорганизмов, так как биотехнологические разработки базируются на глубоком знании характеристик штаммов микробов. Более того, поскольку эти штаммы могут быть защищены патентами, они будут играть ключевую роль в развитии многих отраслей фундаментальных исследований, а также в прикладных исследованиях, в биотехнологии и промышленной микробиологии.

История промышленной микробиологии, и ее современное состояние позволяют проследить тесную связь фундаментальных и прикладных исследований. Столетие назад исследования Пастера, направленные на решение сугубо практических задач, привели к становлению микробиологии, иммунологии и биохимии, а открытие в 1940-х гг. микробиологами-практиками антибиотиков обусловило создание методических приемов, сыгравших решающую роль в развитии молекулярной биологии, и одновременно дало толчок важнейшим изменениям в фармацевтической промышленности. Наконец, за последние 30 лет фундаментальные исследования в области генетики микроорганизмов позволили разработать целый ряд новых методов для промышленного применения. Такая взаимосвязь науки и технологии является решающим условием дальнейшего прогресса промышленной микробиологии.

Перспективы. Решение таких проблем, как нехватка продуктов питания и дефицит белка, будет найдено с помощью биотехнологии за счет снижения стоимости производства аминокислот — необходимого компонента корма домашних животных, благодаря разработке методов получения белка одноклеточных (кормового белка), переработкой парафинов или другого доступного сырья (целлюлозы, агропромышленных или сельскохозяйственных отходов, сточных вод), а также путем клонирования растений и отбора высокоэффективных разновидностей.

В перспективе на основе методов рекомбинантных ДНК биотехнология позволит освоить синтез растительных белков и добиться искусственного фотосинтеза и фиксации азота.

Раздел 1 "Промышленная биотехнология":

Основные направления. Объекты биотехнологии. Перспективы биотехнологии. Основные типы биопроцессов. Принципы промышленного осуществления биотехнологических процессов. Организация биотехнологических производств.

, , , , ,