РНК ДНК

Нуклеиновые кислоты как биополимеры характеризуются следующими основными свойствами.

Размеры молекул и их молекулярная масса. ДНК, выделенные из разных организмов, являются макромолекулами и состоят из огромного числа (до нескольких миллиардов) мономе­ров - нуклеотидов и имеют большие молекулярные массы. Молекулы ДНК линейные (в ядрах эукариот) или перекрученные кольцевые (хромосомы и плазмиды бактерий, ДНК-содержащие вирусы, митохондрии, пластиды, кинетопласты). Однонитевая ДНК обнаружена у некоторых фагов (фаг φ Х174В).

Молекулы специализированных РНК сильно различаются по размерам. Например, тРНК состоят в среднем из 80 нуклеотидов и имеют молекулярную массу около 25 кДа. Однако геномные РНК вирусов состоят из десятков тысяч нуклеотидов, их молекулярная масса может достигать 10000 кДа.

РНК являются однонитевыми молекулами, но они имеют динамичную конформацию. В молекулах РНК последовательности комплементарных оснований могут за счет водородных связей образовывать двухцепочечные фрагменты, увеличивающие стабильность их молекул. Так называемые «шпильки» включают в себя участки с одинаковой, но противоположно ориентированной («палиндромной») последовательностью комплементарных оснований.

Мономеры, из которых построены молекулы нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты состоят из 4 нуклеотидов, которые в зависимости от порядка расположения образуют линейную последовательность, которая может быть как кодирующей, так и некодирующей. Нуклеотиды состоят из азотистого основания, остатка рибозы (в РНК) и дезоксирибозы (в ДНК) и фосфорной кислоты. В состав ДНК входят четыре типа азотистых оснований: пурины – аденин и гуанин, и пиримидины - цитозин и тимин. В РНК входят, как и в ДНК - аденин, гуанин и цитозин, но вместо тимина используется урацил.

В нуклеиновых кислотах в небольших количествах присутствуют минорные азотистые основания: у высших животных и высших растений 5-метилцитозин. У фагов 5-оксиметилцитозин используется вместо цитозина. В неко­торых типах РНК в незначительном количестве встречаются псевдоуридин, метилгуанин и другие минорные основания.

Ковалентная связь, соединяющая нуклеотиды в линейную последовательность (первичная структура). Нуклеотиды соединяются фосфодиэфирными связями, образующимися между 5' углеродом одного остатка сахара и 3' углеродом другого остатка сахара.

Молекула ДНК обладает полярностью; условно принято приписывать этим молекулам направление от 5’ атома к 3’ атому углерода остатков дезоксирибозы.

Уровни структурной организации хроматина. На основании рентгенографическо­го исследования и биохимических дан­ных Уотсон и Кри­к (1953) предложили мо­дель молекулы ДНК.

ДНК со­стоит из двух цепей, образующих правозакрученную спираль с диаметром око­ло 2 нм и шагом около 3,4 нм. На один шаг (период идентичности) приходится 10 пар нукле­отидов. При этом сахарофосфатный остов каждой из цепей обращен наружу, а азотистые основания направлены внутрь спирали и комлементарно взаимодействуют друг с другом. Функциональные группы аденина образуют две водородные связи с тимином другой цепи, а гуанин взаимодействует с цитозином посредством трех водородных связи.

Химический состав ДНК починяется следующим закономерностям. В ДНК количество пуринов равно количеству пиримидинов. Согласно правилу эквивалентности отношения аденин/тимин и цитозин/гуанин) близки к 1. ДНК каждого вида обладает характерным составом, который характеризуют отношением (А + Т)/(Г + Ц). В бактериях могут преобладать либо А + Т либо Г + Ц. У высших животных величина этого отношения колеблется в пределах 1,3 – 1,5; у высших растений эта величина находится в пределах 1,1 – 1,7. Для человека эта величина составляет 1, 51 (по Уотсону).

ДНК в клетках живых организмов существует либо в виде хроматина, либо в виде хромосом, различающихся степенью конденсации и транскрипционной активностью. В этой связи различают транскрипционно активный эухроматин и неактивный гетерохроматин. Максимальная степень конденсации характерна для метафазных хромосом.

Образование хроматина происходит в результате взаимодействия ДНК с гистоновыми и негистоновыми белками, последовательной укладки.

В хроматин входят гистоны пяти типов: Н1 (линкерный гистон) и Н2А, Н2В, Н3, Н4 (нуклеосомные гистоны). Негистоновые белки представлены структурными белками, регуляторными белками и ферментами. В частности в функционировании ДНК важную роль играют белки HMG (High Mobility Group).

Различают несколько уровней упаковки ДНК в хроматин.

В начале ДНК взаимодействует с гистоновыми белками с образованием нуклеосом. Основу нуклеосомы составляет гистоновый октамер, в который входит по две молекулы разных гистонов. Нуклеосому «обматывает» фрагмент ДНК длиной около 200 п.н.. Линкерный фрагмент ДНК, остающийся между двумя нуклеосомами имеет длину до 60 п.н.. Нуклеосомный уровень организации ДНК позволяет компактизировать ее молекулу в 6–7 раз и приводит к образованию нити хроматина толщиной 10 мкм.

Нуклеосомы укладываются в хроматиновую фибриллу. Согласно соленоидной модели, на каждый виток фибриллы, имеющей толщину около 30 мкм, приходится 6-7 нуклеосом. При этом размеры ДНК уменьшаются в 25-30 раз.

Хроматиновые фибриллы формируют петлеобразные структуры, в которых образуются суперспирализованные домены, содержащие 15-150 тыс. п.н.. Петли хроматина отходят под углом от основной оси хромосомы. Данная схема организации видна при анализе в световой микроскоп интерфазных хромосом типа «ламповых щеток». Фиксацию петель хроматина по середине и в целом осуществляют специфические белки.

Доменная организация обеспечивает специфическую укладку хроматина в метафазных хромосомах. Поперечная исчерченность митотических хромосом в определенной мере отражает порядок расположения генов в молекуле ДНК.

Рисунок 1.1 - Уровни структурной упаковки хроматина

Молекула ДНК имеет динамичную конформацию, функционирование ДНК связано с переходом гетерохроматина в эухроматин.

Рисунок 1.2 - Модель организации интерфазной хромосомы, основанная на представлении об организации ядерного матрикса как системы канальцев (цит. по Корочкин Л.И. 2002)

Функциональной единицей ДНК является ген. Ген функционирует как элемент генома. Геномом называется одинарный полный набор генетического материала организма. В него входят последовательности нуклеотидов ДНК гаплоидного набора хромосом, ДНК митохондрий и хлоропластов.

Величина генома выражается в парах нуклеотидов (п.н.). Геном человека состоит из 3,5x10⁹ п.н.. Изучением геномов организмов, относящихся к различным таксономическим группам, занимается геномика (структурная, функциональная, эволюционная).

Ген рассматривают как совокупность сегментов ДНК (единицу транскрипции, регуляторные последовательности и др.), , которые образуют экспрессирущуюся единицу, обусловливающую образование специфи­ческой функциональной РНК или белка. Единица транскрипции представляет собой - протяженный участок ДНК, кодирующий по­следовательность первичного РНК-транскрипта. Единицу транскрипции составляют кодирующая последовательность, 5'-лидерная последовательность и 3'-трейлерная последовательность, которые транскрибируются, но не транслируются. В генах, кодирующих рРНК, имеются промежуточные последовательности (спейсеры), удаляемые в ходе процессинга первичных РНК-транскриптов.

Правильную транскрипцию организует промотор, однако и для образования правильного 3'-конца зрелой РНК также существует специфическая последовательность. К регуляторным последовательностям относят энхансеры (позитивная регуляция) и сайленсеры (негативная регуляция), которые влияют на инициацию транс­крипции гена, хотя сами могут находиться на значительном удалении от точки инициации транскрипции.

Гены прокариот структурно организованы достаточно просто. Промотор находится под контролем регуляторного элемента, и вся эта конструкция определяет эффективность процесса транскрипции с единицы транскрипции гена. У прокариот различают гены, кодирующие один белок и гены, кодирующие несколько белков. В последнем случае единица транскрипции гена является полицистронной. Организация нескольких генов в оперон (полицистронная единица транскрипции) стала эволюционным достижением прокариот. Несколько генов, кодирующих белки, участвующие в едином метаболическом цикле, оказываются под влиянием одного регуляторного элемента (лактозный, триптофановый, арабинозный опероны).

Гены вирусов и бактериофагов имеют по сравнению с генами прокариот более сложное строение, поскольку их генетические процессы зависят от геномов клеток хозяев, в которых и осуществляется их клеточный цикл. В частности, у бактериофагов отмечено перекрывание генов, у вирусов наряду с экзонами присутствуют интроны.

Внутренние правые

регуляторные элементы регуляторные

промотор элементы

5´ +1 экзон 1 экзон 2 экзон 3 3´

3´ левые интрон 1 интрон 2 3´трейлерная 5´

регуляторные ↑ последовательность

элементы 5´лидерная

последовательность

Единица транскрипции------//

Рисунок 1.3 - Структурные особенности гена эукариот, кодирующего белок. Транскрипция осуществляется слева направо. Значащая цепь имеет левый 5-конец и правый 3-конец. Положение первого нуклеотида транскрипта обозначают числом +1, а нуклеотидов, расположе­нных справа от него (т.е. внутри еди­ницы транскрипции), большими положительными числами (например, + 29). Нуклеотиды, находящие­ся слева от +1 (нетранскрибируемые последовательности), обозначаются отрицательными числами (например, -55) (Сингер, Берг, 1997)

Гены эукариот имеют сложную организацию, обусловленную усложнением генетического контроля над их экспрессией. Они имеют прерывистое мозаичное строение: экзоны (кодирующие последовательности), разделяются интронами (вставочные последовательности). Как правило, длина интронов в несколько раз превышает длину экзонов. Различают три класса генов эукариот. Гены класса 1 кодируют рРНК, гены класса 2 кодируют мРНК, гены класса 3 кодируют тРНК. Гены разных классов имеют характерные особенности промоторов и транскрибируются различными РНК-полимеразами.

Типичный ген человека состоит в среднем из 28000 оснований (в кодирующую последовательность входят 1340 п.н.) и содержит восемь экзонов.

Существует несколько классификаций генов. В зависимости от локализации в клетке различают ядерные, и цитоплазматические гены, локализованные в хлоропластах и митохондриях. По функциональному значению различают: структурные гены, кодирующие белки (их выявляют с помощью мутаций, нарушающих структуру белков), и регуляторные гены, участвующие в регуляции экспрессии гена. В зависимости от того, как влияют гены, точнее их белковые продукты на физиологические процессы различают: летальные, условно летальные, супервитальные гены, гены-мутаторы, гены-антимутаторы и другие.

Гены объединяются в генные сети, под влиянием (генетическим контролем) которых находятся все метаболические и физиологические процессы в организме. Под регуляторным контролем генных сетей находится деление клетки (митоз и мейоз). Эмбриогенез также находится под влиянием сложных и разветвленных генных сетей. Выделяют группы тесно сцепленных генов, образующих кластеры, которые проявляют свое действие последовательно, и определяют нормальную сегментацию тела, получившие название гомеобоксных генов. Под их влиянием запускается определенный путь эмбрионального развития: в контролируемых клетках экспрессируется специфический набор генов и в результате формируется тот или иной сегмент тела. В частности, гены комплекса bithorax (ВХ-С) дрозофилы необходимы для нормальной сегментации груди (thorax) и брюшка (abdomen). Гомеобоксные гены впервые были выявлены у дрозофилы, но они также обнаружены и у млекопитающих, причем у разных организмов они имеют высокую гомологию.

Первичные РНК-транскрипты, образующиеся в ядрах эукариотических клеток, созревают. Важнейшим этапом образования функционально активных молекул РНК является сплайсинг, протекающий по следующей схеме. Специфические рестриктазы разрезают РНК-транскрипт по границам экзон-интрон, затем фрагменты РНК, соответствующие экзонам, сшиваются лигазой.

Фенотипическое разнообразие клеток эукариот определяется спектром синтезируемых в них белков, что в свою очередь связано с дифференциальной экспрессией генов. Подчеркнем, что экспрессия генов тонко регулируется, но контроль над генетическими процессами осуществляется также и на уровне созревания РНК и на уровне трансляции.

ДНК в изобилии содержит некодирующие последовательности, которые, как полагают, могут участвовать в регуляции активности генов и организации хромосом. Среди некодирующих участков доминируют повторяющиеся последовательности, которые могут быть короткими, как, например динуклеотидный повтор GCGCGCGC…, или длинными, например, Alu-последовательность, имеющая протяженность около 300 п.н. Отметим, что такие последовательности в геноме человека могут повторяться до 300000 раз, занимая до 5% всего генома. Повторяющиеся последовательности с различным числом копий используют для оценки изменчивости в популяциях.

В геномах эукариот микросателлитные последовательности – короткие тандемные повторы (STR – short tandem repeats) имеют небольшую длину (2-6 нуклеотидов). У человека изучено более 5000 вариабельных динуклеотидных микросателлитных последовательностей, которые рассеяны по всему геному.

Среди повторяющихся последовательностей встречаются псевдогены, которые возникают вследствие мутаций (делеции или вставки), приводящих к изменению рамки считывания. Псевдогены неспособны производить функциональные РНК-продукты. Семейство генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) состоит более чем из 100 генов, в числе которых и псевдогены.

Важнейшей составляющей геномов являются ДНК-мобильные элементы, которые способны перемещаться по геному и во многом влияющие на процесс генетической рекомбинации.

ДНК реализует генетическую активность в генетических процессах: транскрипции, трансляции, репликации, репарации и генетической рекомбинации.

Способность ДНК к метаболическим превращениям лежит в основе генетических процессов – репликации, репарации - сохраняющих святая святых клетки ее гены. Важнейшая роль ДНК - организация матричного синтеза. Транскрибирование генов направлено на образование различных РНК-продуктов (транскриптов) из которых в процессе созревания образуются мРНК, рРНК, тРНК и другие РНК, обладающие регуляторной активностью или выполняющие структурные функции.

Для правильной транскрипции в гене должны присутствовать: кодон инициации, множество смысловых кодонов и кодон терминации. Три подряд расположенных нуклеотида представляют собой кодон, который и определяет, какая аминокислота будет располагаться в данной позиции в белке. Например, в молекуле ДНК последовательность оснований ТАС является кодоном для аминокислоты метионина, а последовательность ТТТ кодирует фенилаланин. В молекуле мРНК вместо тимина (Т) присутствует основание урацил (У). Таблица генетического кода во всех руководствах представлена символами мРНК. Из 64 возможных кодонов смысловыми являются 61, а три триплета - УАА, УАГ, УГА - не кодируют аминокислоты и поэтому были названы бессмысленными, однако на самом деле они представляют собой знаки терминации трансляции.

Генетическая рекомбинация представляет собой реорганизацию генома, направленную на создание таких комбинаций генов и регуляторных элементов, которые были бы в плане регуляции более эффективными.

Методология анализа нуклеиновых кислот постоянно развивается и пополняется новыми молекулярными методами исследования. Современными научными направлениями являются генотипирование (характеристика последовательностей ДНК, выявление мутаций) и фенотипирование (определение белкового разнообразия в клетке и организме). Структуру генов изучают посредством молекулярного клонирования и секвенирования ДНК.