Стадия элонгации

1. К 3’-ОН группе праймера присоединяется ДНК-полимераза III которая по принципу комплементарности синтезирует дочернюю цепь ДНК в направлении 5’®3’. Точность синтеза определяется тем, что феpмент ДНК-полимераза III катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание предыдущего нуклеотида комплементарно соответствующему основанию матрицы. Если не произошло образование водородных связей между присоединенным нуклеотидом и матрицей, фермент возвращается, вырезает неправильный нуклеотид с 3'-конца цепи за счет экзонуклеазной активности, после чего ДНК-полимеpаза продолжает присоединять правильные нуклеотиды в направлении 5'®3'. В pезультате достигается высокая точность матричного синтеза (не более одной ошибки на 1-10 миллиаpдов нуклеотидных остатков). Если направление синтеза дочерней цепи ДНК и направление движения репликативной вилки совпадают, то цепь синтезируется непрерывно и называется лидирующей.

2. Если направление синтеза ДНК и движение репликативной вилки не совпадают – цепь синтезируется фрагментами и называется запаздывающей. Фрагменты, синтезиpо­ванные в запаздывающей цепи, называются фрагментами Рейджи Оказаки и состоят из 1000-2000 нуклеотидов у пpокаpиот и 100-200 нуклеотидов у эукариот.

3. После завеpшения синтеза фpагмента Оказаки РНК-затpавка (пpаймеp) удаляется нуклеотид за нуклеотидом с помощью 5'®3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеpазы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеpазной pеакции, осуществляемой ДНК-полимеpазой I (пpи этом в качестве затpавки используется 3'-конец пpедыдущего фpагмента Оказаки). Новый фрагмент Оказаки присоединяется к отстающей цепи ДНК с помощью феpмента ДНК-лигазы. Источником энергии для этой pеакции у эукаpиот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК.

Теpминациясинтеза ДНК наступает вследствие исчеpпания матpицы. Репликационные пузыри сливаются, молекулы дочерней цепи ДНК сшиваются ДНК-лигазой и на каждой матpице обpазуется дочеpняя цепь ДНК.

Репликация у эукариот.Общие механизмы репликации у эукариот аналогичны таковым у прокариот. Как и у прокарит, репликация у эукариот происходит одновременно на обеих цепях. Единицей репликации у эукариот является репликон, размеры которых колеблются от 50 до 120 мкм. В клетках млекопитающих содержится от 10 000 до 100 000 репликонов.

Основным ферментом синтеза ДНК у эукариот является ДНК-полимераза δ. Функции ДНК-полимеразы β подобны таковым для ДНК-полимеразы I прокариот ДНК-полимераза γ катализирует процессы полимеризации нуклеотидов в митохондриях.

Для репликации генома человека необходимо около 8 ч. Скорость репликации у E.coli составляет 1000 пар оснований в секунду. Репликация у эукариот происходит в 10 раз медленнее, чем у прокариот и составляет 100 пар оснований в секунду. Каждый репликон синтезируется приблизительно 1 час. Низкая скорость репликации у эукариот обусловлена, вероятно, формированием нуклеосом и наличием хромосомных белков. Гетерохроматин реплицируется медленнее, чем эухроматин. Кроме того, ДНк-полимеразы эукариот менее активны по сравнению с прокариотическими ферментами.

В отличие от прокариот, эукариотическая ДНК линейная. Как указано выше, репликация происходит в двух направлениях от одной точки инициации (хромосома эукариот имеет много таких точек). 5’-конценвая область лидирующей цепи реплицируется полностью. Но этого не происходит при синтезе запаздывающей цепи, потому что участвующий в образовании фрагментов Оказаки РНК-праймер расположен у 3’-конца матричной цепи. После удаления праймера эти концы оказываются нереплицированными и не существуют механизма, позволяющего восполнить их, используя ДНК-синтезирующий комплекс, описанный выше. Для восполнения теряемых частей требуются РНК-праймер, но матриц, с которых их можно было бы образовывать, нет. Это означает, что с каждым клеточным делением хромосомы будут последовательно укорачиваться. Решение проблемы состоит в том, что на концах хромосом эукариот находятся специальные повторяющиеся последовательности ДНК, которую называют теломерной ДНК (содержащие ее концы хромосом – теломеры).

Теломерымлекопитающих представляют собой короткую последовательность нуклеотидов ТТАГГГ. Число теломерных последовательностей различно в клетках разных тканей. Специфическая ДНК полимераза (ДНК-теломераза) добавляет эти последовательности (одну за другой) к 3’-концу предшествующей теломерной ДНК и таким образом удлиняет ее. Теломераза имеет две особенности: (1) использует РНК в качестве матрицы для синтеза ДНК – это обратная транскриптаза и (2) матрица включена в структуру фермента. У человека РНК имеет последовательность, включающую 1,5 повтора, комплементарных ТТАГГГ. Матрица РНК гибридизируется с концом теломерной ДНК, затем постепенно (по одному нуклеотиду) добавляется еще один фрагмент. После этого фермент перемещается и связывается с концом нового, только что образованного фрагмента. Таким образом теломер непрерывно достраивается. На удлиненном теломере одной цепи затем формируется комплементраная цепь, так что теломер имеет двухцепочечную структуру. Однако пока не ясно как это происходит. По-видимому, в этом процессе участвует ДНК-полимераза.

При исследовании процессов повреждения ДНК в живой клетке следует учитывать, что ДНК в них связана с белками, в эукариотических клетках организована в виде нуклеосом с последующими уровнями компактизации до стадии хромосом. При нормальных значениях рН, температуры и давления в клетке возможны несколько типов повреждения ДНК.

1. Возможно гидролитическое отщепление аминогрупп от цитозина, аденина и гуанина с образованием урацила, гипоксантина и ксантина, соответственно. Наиболее часто происходит дезаминирование цитозина с образованием урацила: примерно 1000 на животную клетку в сутки (дезаминирование пуринов происходит в 50-100 раз реже). Дезаминирование цитозина выше на два порядка в одноцепочечной ДНК. Гидролиз N-гликозидных связей ведет к образованию свободных от оснований сайтов за счет отщепления пуриновых и пиримидиновых оснований. Пурины менее устойчивы к гидролизу – возможно до 10000 депуринизаций на животную клетку в сутки (депиримидинация в 20 раз реже). Апуриновые и апиримидиновые сайты не участвуют в матричных синтезах.

2. Оксидативные повреждения связаны с действием свободно-радикальных форм кислорода, синглетного кислорода и пероксидов. Основные пути образования свободно-радикальных форм кислорода локализованы в митохондриях и осуществляются в окислительном фосфорилировании, а также при синтезе оксида азота, образовании пероксидов в процессе фагоцитарной активности лейкоцитов. Ультрафиолет, ионизирующее излучение и ряд ксенобиотиков активируют пкакции свободно-радикального окисления. Их действие выявляется, когда интенсивность воздействующего фактора превышает возможности защитных и репаративных систем клетки. Оксидативные повреждения могут приводить к разрыву полинуклеотидной цепи за счет повреждения дезоксирибозы, разрыв конечных 3’5’-фосфодиэфирных связей, что нарушает присоединение следующего нуклеотида ДНК-полимеразой III. В настоящее время описано 40-60 различных типов повреждений азотистых оснований (насыщение двойных связей в циклических структурах, разрывы колец, присоединение новых групп к кольцам оснований и т.п. Особенно мутагенным является 8-оксогуанин. Все эти изменения могут привести к серьезным нарушениям информационной роли полинуклеотидных цепей ДНК.

3. Метилирование ДНК в клетке происходит ферментативным и неферментативным путями. Малые молекулы (пептиды, полиамины и S-аденозилметионин способны к неферментативному метилированию с образованием 7-метилгуанина и 3-метиладенина. Если 7-метилгуанин нетоксичен, то 3-метиладенин способен блокировать репликацию. Считают, что в сутки может образовываться 600 остатков 3-метиладенина на человеческую клетку. Бактериальные и животные ферменты – метилтрансферазы обеспечивают метилирование цитозина с образованием 5-метилцитозина. Это основание в полинуклеотидой цепи является одним из маркеров для действия рестриктаз.

ДНК является мишенью для действия многих неблагоприятных факторов внешней среды.

1. Действие ультрафиолетовых лучей. Солнечный ультрафиолет подразделяют на три вида по длинам волн: УФ-А (длинноволновой), УФ-В (средневолновой) и УФ-С (коротковолновой). УФ-С абсорбируется в стратосфере озоновым слоем. У человека УФ-В может вызывать рак кожи. При действии ультрафиолета возможно образование тиминовых димеров (УФ-С или при хроническом действии УФ-В).

2. Ионизирующее излучение повреждает ДНК посредством образования свободных радикалов. Ионизирующее излучение способно вызывать «летальные» разрывы обеих цепей ДНК. Особенно опасны трансурановые элементы, альфа-частицы которых при тесном контакте с молекулами ДНК способны повреждать различные химические связи полинуклеотидных цепочек. Отметим, что максимальное влияние трансурановых элементов, загрязнивших территории после аварии на ЧАЭС, предсказывается через 25-40 лет.

3. ДНК является мишенью для эндогенных химические вещества и ксенобиотиков. К таким веществам относятся вещества, определяющие неферментативные превращения метаболитов «реактивные» молекулы, чаще всего обеспечивающие электрофильную атаку нуклеофильных центров в дуплексах ДНК. К неферментативным повреждающим ДНК веществам относят алкилирующие агенты (например метил-метановые сульфонаты). В результате их действия возникают фосфотриэфиры и весьма мутагенное соединение О⁶-метилгуанин. Бифункциональные алкилирующие агенты имеют две реактивные группы, способные создавать перекрестные связи в дуплексе ДНК через остатки гуанина. Положительный эффект этого используется в действии противоопухолевого препарата cis-диаминодихлорплатиума. Другим примером метаболической активации ДНК являются повреждения бензапиреном, который является ароматическим углеводородом, поступающим в организм при курении и употреблении в пищу копченостей. В организме он гидроксилируется микросомальной монооксигеназной системой (цитохром Р-450 и превращается в продукт, повреждающий ДНК.

Итак, множество химических и физических агентов (ионизирующая радиация, УФО, алкилирующие агенты) вызывают в ДНК повреждения 4 основных типов.

1. Затрагивающие единичные нуклеотиды: депуринизация; дезаминирование цитозина до урацила; дезаминирование аденина до гипоксантина; алкилирование оснований; вставка или делеция нуклеотида; включение основания-аналога.

2. Затрагивающие пару нуклеотидов: УФ-индуцируемое образование тиминовых димеров; поперечные сшивки бифункциональным алкилирующим агентом.

3. Разрывы цепей: ионизирующая радиация; радиоактивная дезинтеграция каркаса ДНК.

4. Поперечные сшивки: между основаниями одной цепи или разных цепей; между ДНК и молекулами белка (например, гистонами).

Поврежденные участки могут быть подвергнуты репарации, замещены путем рекомбинации или остаться без изменений. В последнем случае возникают мутации, потенциально ведущие к гибели клетки.

Основной путь репарации ДНК включает 3 этапа:

1. Измененный участок ДНК распознается и удаляется при помощи ферментов ДНК-репарирующих эндонуклеаз.

2. ДНК-полимераза I связывается с 3’-концом поврежденной цепи ДНК и заполняет брешь, присоединяя нуклеотиды друг за другом комплементарно неповрежденной цепи ДНК.

3. ДНК-лигаза сшивает фрагменты ДНК и, тем самым, завершает восстановление структуры ДНК.