Лизоцим
По химической структуре лизоцим относится к полипептидам, содержащим в молекуле около 130-160 аминокислотных остатков. Он растворим в слабокислой среде, устойчив к непродолжительному кипячению, к трипсину.
Лизоцим (мурамидаза) способен расщеплять основное вещество клеточной стенки бактерии муреин путем разрушения связи между первым углеродным атомом n-ацетилмурамовой кислоты и четвертым углеродным атомом n-ацетилглюкозамина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. В результате этого изменяется ее проницаемость.
Лизоцим является мощным защитным фактором слизистой оболочки полости рта, глаза, содержится в слезах, слюне, крови, материнском молоке, тканях различных внутренних органов. Высокая концентрация лизоцима выявляется в околоплодных оболочках и водах плода.
Основная масса лизоцима синтезируется, по-видимому, тканевыми макрофагами и нейтрофилами.
Лизоцим выполняет в организме важные биологические функции: бактерицидное действие, стимулирующее воздействие на фагоцитоз, способность нейтрализовать некоторые микробные токсины, а также противовоспалительное действие.
Наибольший литический эффект лизоцим оказывает на культуру микрококка (in vitro). Действие лизоцима можно оценить фотометрически по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка.
Методика. Готовят исходный раствор кристаллического лизоцима 100 мг/мл, а из него 9 различных разведений.
Все разведения как лизоцима, так и бактерий, делают на 1/15 М фосфатном буфере, рН=6,2 (табл. 11).
Для приготовления взвеси бактерий смывают буферным раствором со скошенного агара суточную культуру микрококка и стандартизируют его на ФЭК-М по левому барабану до оптической плотности 0,66.
Таблица 11
Схема титрования лизоцима
| пробирки | |||||||||
| 1. Исследуемая сыворотка (1:10), мл | 0,02 | 0,04 | 0,06 | 0,08 | 0,10 | 0,20 | 0,30 | 0,40 | 0,50 | - |
| 2. Физ. раствор, мл | 0,48 | 0,46 | 0,44 | 0,42 | 0,40 | 0,30 | 0,20 | 0,10 | - | 0,5 |
В каждую пробирку с приготовленными разведениями лизоцима вносят по 2 мл взвеси микрококка и выдерживают при 37°С 30 мин в термостате. Замеряют оптическую плотность на ФЭК-М по правому барабану в кювете № 2 с зеленым светофильтром. На основе полученных данных строят калибровочную кривую.
Для определения количества лизоцима исследуемый материал в объеме 0,1 мл добавляют к 0,4 мл буфера и к полученной смеси приливают 2 мл стандартизованной смеси микрококка. Контролем является пробирка, не содержащая исследуемого материала. Инкубируют в термостате 30 минут при 37°С и на ФЭК-М определяют оптическую плотность в опытной и контрольной пробирках. По калибровочной кривой устанавливают концентрацию лизоцима в исследуемом материале.
Дата добавления: 2015-04-25; просмотров: 919;