Воздействие на клетки перепада давления

В таких дезинтеграторах клетки могут находиться либо во взвешенном состоянии в жидкости (тогда она пропускается через сопло), либо в замороженном состоянии (тогда их продавливают через узкую щель методом экструзии). В первом случае действуют два эффекта: кавитационный с образованием срезающих турбулентных пульсаций и декомпрессионный, в результате которого при резком сбросе давления клетка как бы взрывается изнутри.

Во втором случае влияют именно механические воздействия кристаллов льда на стенки клетки. В жидкостном варианте давление создается плунжерным насосом или прессом. Величина давления варьируется от 10 до 210 МПа, чаще – 50 - 55 МПа. Экспериментально установлена связь показателя эффективности R с давлением:

где N - число «пропусканий» суспензии через дезинтегратор; Р - давление в дезинтеграторе.

Почти кубическая зависимость от давления показывает, что его надо увеличивать. Но и здесь надо проводить мероприятия по охлаждению зоны декомпрессии. Недостатки этого способа:

- необходимость высоких давлений;

- низкая производительность из-за малого диаметра отверстий;

- плохая работа на мицелиальных микроорганизмах (они забивают отверстие даже при столь высоких перепадах давления).

Те же недостатки характерны и для экструзии. Здесь давления достигают 550 МПа. Ясно, что этот способ можно использовать лишь в лаборатории.

Ультразвуковая дезинтеграция

Применяются частоты озвучивания суспензии 15-25 кГЦ. Здесь также происходит нагрев суспензии. Для больших масштабов метод мало применим, так как отсутствуют мощные генераторы ультразвука, к тому же в толстых слоях жидкости происходит гашение звука. Показатель эффективности дезинтеграции R колеблется в широких пределах - от 10 - 20 % до 90 - 95 % и даже до 100 % C различными, конечно, затратами.

Немеханические методы

Сушка

Наиболее простой метод, который резко изменяет структуру клеточной оболочки. После сушки, в результате которой клетки не остаются живыми и теряют внутриклеточную влагу, в оболочке клетки появляется много «трещин». Ресуспендирование высушенных клеток в водной фазе позволяет выделить внутриклеточные компоненты. Недостатком метода является то, что при горячей сушке денатурируются ферменты и инактивируются многие биологически активные вещества.

Лизис

Разрушение, «разъединение» клеточной оболочки, кажется наиболее привлекательным для решения задач выделения внутриклеточных продуктов. Методы лизиса можно подразделить на физические, химические и ферментативные в зависимости от характера воздействий, вызывающих лизис клеточной оболочки.

Физические методы лизисавключают в себя метод осмотического шока и метод попеременного замораживания-оттаивания.

- Осмотический шок. По этому методу в суспензии сначала создается высокое осмотическое давление (например, с помощью 1 М глицеринового или 1 М сахарозного раствора). Затем производится резкое разбавление суспензии водой. При этом клетки разрушаются под действием высокого внутриклеточного осмотического давления. Подобным же образом действуют растворы солей. Есть, например, такие микроорганизмы галофилы, которые культивируются на высококонцентрированных солевых средах. По окончании процесса культивирования разбавление культуральной жидкости водой почти сразу приводит к лизису клеток. Это используется в технологии - не требуется специальных ухищрений по дезинтеграции клеток.

- Замораживание-оттаивание. Известно, что замораживание используется в противоположных целях - для длительного хранения микроорганизмов в жизнеспособном состоянии. Но при этом и замораживание, и оттаивание проводят в специальном программированном режиме, препятствующем повреждению клеток. При дезинтеграции, наоборот, используют режимы, способствующие повреждениям клеточных оболочек. Недостатками метода являются большая длительность и энергоемкость и к тому же невысокая степень дезинтеграции. Это не позволяет широко использовать данный метод в промышленном масштабе.

Химические способы лизиса предусматривают воздействия на клетку химических реагентов различной природы, которые приводят к деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизмов. Обработка суспензии микроорганизмов такими реагентами, как щелочь, кислота, мочевина, аммиак, бутанол, толуол, пероксид водорода, детергенты, повышает проницаемость клеточных стенок. Благодаря этому биополимеры выводятся из клеток в раствор. Для усиления действия возможно использование упомянутых реагентов в комплексе с повышением температуры, резким изменением величины рН.

Некоторые антибиотики, ингибирующие рост клеток микроорганизмов, оказывают литическое воздействие на клетки. Среди реагентов упоминают также глицерин, олеиновую кислоту, способствующие быстрому лизису клеток. Эти способы имеют важный недостаток. Химические реагенты могут вступать в реакцию с извлекаемыми из клетки биополимерами и к тому же остаются в лизированной суспензии, откуда их потом трудно выделять.

Ферментативные способы лизиса используют биологические агенты для ферментативного лизиса клеточных оболочек. Такие методы являются одними из наиболее перспективных методов. Среди этих методов различают:

- автолиз - разрушение клеточных стенок собственными клеточными ферментами;

- ферментолиз - добавление протеаз, гликаназ и других ферментов в раствор;

- добавление пенициллина как вещества, препятствующего синтезу материала клеточной стенки;

- фаголизис – разрушение клеток под воздействием фагов.

Автолиз

Для разложения клеточных стенок собственными протеолитическими ферментами клетки необходимо сначала осуществить шоковое воздействие или величиной рН (обычно закислением), или температурой, или затравочной дозой таких реагентов, как толуол, хлороформ, этилацетат, олеиновая кислота. Далее процесс автолиза протекает при температуре, свойственной данному виду микроорганизмов. Например, автолиз дрожжей происходит при 45 - 50°С. Надо отметить, что это довольно длительный процесс (12 - 24 ч).

Ферментолиз

Недостатки автолиза привели к использованию интродуцируемых в суспензию внеклеточных ферментов, вызывающих лизис клеточной стенки. Исходя из рассмотренного ранее состава клеток, такими ферментами могут быть протеазы, глюканазы, манназы и иногда лизоцим, представляющий собой комплекс различных ферментов. Для этих целей эффективно применение иммобилизованных ферментов, которые можно использовать многократно. Получаемые при автолизе и ферментолизе растворы часто содержат легкоусвояемые вещества (белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и др.). Поэтому автолизаты и ферментолизаты не просто полупродукт для выделения внутриклеточных составляющих, но также могут быть хорошим кормовым продуктом. Он особенно подходит для молодняка рыб и животных, которые еще не приспособились своими ферментами переваривать клеточные оболочки и разрушать их. Клеточные оболочки, также являющиеся продуктом процесса дезинтеграции, могут быть отделены от раствора, высушены, после чего их вполне можно использовать как хороший сорбент для вредных примесей в пищевых продуктах или как тот же корм для животных.