Вопрос 75. Трансформация. Типы векторов, Безвекторные системы.

Трансформация – непосредственный перенос гена в чужеродный геном.

Система, обеспечивающая такой перенос, получила название вектора.

Плазмидные векторы.

В качестве векторов используются плазмиды бактерий, и для трансформации растений чаще всего Ti-плазмида почвенной бактерии Agrobakterium tumefaciens. В природе A. tumefaciens проникают в клетки корней растений и там размножаются. При этом часть плазмидной ДНК (Т-ДНК) встраивается в хромосомы поврежденных (зараженных) клеток, индуцируя образование галлов (опухолей).

При трансформации используют разоруженную Ti-плазмиду, без онкогенов, вызывающих образование галлов. Вместо них встраивают нужные исследователю гены и плюс репортерные гены, подтверждающие о встраивании Т-ДНК в геном растения. Это гены неомицинфосфотрансферазы II (NRTII), дигидрофолатредуктазы,гигромицинфосфотрансферазы(НРТ), в результате экспрессии которых трансформированная клетка становится устойчивой к антибиотикам канамицину, мететрексиату и гигромицину В. При культивировании трансформированных клеток на среде с данным антибиотиком выживают только клетки, у которых Т-ДНК включена в геном. Помимо встроенных генов Ti-плазмида должна содержать гены vir-областей (vir А, vir В, vir С, vir D, vir G), обеспечивающих сам процесс встраивания Т-ДНК в хромосому. Была создана бинарная система трансформации, состоящая из небольшой , реплицирующейся как в E.coli, так и в

A. tumefaciens, плазмиды (5-10 тыс. п.н.), несущей переносимые гены, и Ti-плазмиды, несущей vir-гены с делетированной Т-ДНК.

С использованием A. tumefaciens легче трансформировать двудольные растения (горох, табак и т.п.), чем однодольные (пшеница, кукуруза). Но это зависит от метода трансформации. К настоящему времени создано огромное число плазмид, которые используются в качестве векторов при трансформации, как растений, так и животных.

Вирусные векторы.

При трансформации растений используют и векторы, сконструированные на основе растительных вирусов. Но их набор ограничен, так как у большинства растительных вирусов генетическим материалом является РНК, и только у некоторых из них, таких , как вирус мозаики цветной капусты (CaMV) и группы вирусов Gemini, наследственным материалом служит ДНК. Недостаток вирусных векторов – ограниченная протяженность встраиваемых генов (от 200 до 500 п.н.) и высокая специфичность по отношению к видам растений. Так, вирус мозаики цветной капусты можно использовать только при трансформации растений, относящихся к семейству крестоцветных.