Глава 2. Мелатонин

Проведенные в США исследования показали, что регулярный прием витаминов С, Е или поливитаминных пищевых добавок не приводит к существенному снижению развития сердечно-сосудистых заболеваний и смертности от них. Другое исследование показало, что прием витаминов С, Е и каротиноидов не снижает риск инсультов у пациентов, не страдающих диабетом или сердечно-сосудистыми заболеваниями. У тех же, кто страдал такими заболеваниями, прием витамина Е по 400 IU в день в течение 4,5 лет не оказало никакого влияния на исход заболевания сердца и нефропатии. Отмечен случай повышения артериального давления у 2 пациентов с диабетом на фоне приема витамина Е. Антиоксидантные витамины не снижали риск смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, а в 11 исследованиях было отмечено, что высокие дозы витамина Е немного, но достоверно увеличивали общую смертность пациентов (от различных причин) по сравнению с плацебо. Другие 68 исследований, проведенные в общей сложности на 232 тысячах человек, также выявили повышение уровня общей смертности на фоне приема антитоксидантных витаминов.

Уже довольно большое количество исследований показали, что мелатонин значительно лучше, чем классические антиоксиданты противостоит свободнорадикальному повреждению биологических макромолекул. В исследованиях in vivo мелатонин оказался эффективнее витамина Е, b-каротина и витамина С. Кроме того, мелатонин безопасен для глаза, высоколипофилен и хорошо проникает в ткани глаза. Он сочетает антиоксидантные и антиадренэргические свойства, что может обеспечить его эффективность при лечении как увеита, так и глаукомы.

Мелатонин – основной гормон пинеальной железы (эпифиза). Его секреция происходит в ночное время из аминокислоты триптофана под действием 4 ферментов. Уровень активности этих ферментов регулируется супрахиахматическим ядром (СХЯ) гипоталамуса, несущим информацию о сменен режимов дня. В митохондриях пинеалоцитов триптофан при помощи триптофангидроксилазы окисляется до 5-гидрокситриптофана, который декарбоксилируется в цитозоле декарбоксилазой ароматических аминокислот до серотонина. В ночное время серотонин N-ацетилируется при участии серотонин-N-ацетилтрансферазы в непосредственный предшественник мелатонина N-ацетилсеротонин, который, в свою очередь, после О-

метилирования ферментом гидроксииндол-О-метилтрансферазой (ГИОМТ) превращается в конечный продукт мелатонин.

2.1 Рецепторы мелатонина

У человека и млекопитающих действие мелатонина опосредуется двумя видами рецепторов – мембранными, связанными с G-белками, и ядерными, относящимся к суперсемейству рецепторов ретиноевой кислоты. Экспрессия рецепторов, как и синтез мелатонина, подчиняется циркадианным ритмам.

Мембранные рецепторы МТ1 и МТ2 расположены в роговице, склере, сетчатке и кровеносных сосудах сетчатки человека, крысы, и многих других видов. Кроме того, рецептор МТ1несут две трети дофаминэргических нейронов. Экспрессия МТ1 имеет суточные колебания и противофазу к колебаниям синтеза мелатонина. Показано, что мелатонин регулирует экспрессию МТ1 как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне, подавляя экспрессии гена МТ1, и одновременно индуцирует интернализацию существующих рецепторов за счет β-аррестин-опосредованного механизма. Рецепторы, попавшие внутрь клетки, могут быть вторично использованы или убиквитинизированы и разрушены.У мышей, нокаутных по гену МТ1, с возрастом происходило значительное (на 25-30%) уменьшение числа ганглиозных клеток сетчатки. Это позволяет предположить, что МТ1 специфичны для этих клеток. Авторы исследования предлагают использовать таких мышей в качестве модели для изучения глаукомы, поскольку наблюдалось по крайней мере 2 признака открытоугольной глаукомы: повышенное ВГД и уменьшенное количество ганглиозных клеток. В тоже время у нокаутов по МТ1 было зафиксировано небольшое (2 мм рт. ст.), но достоверное снижение ВГД ночью. Рецепторы МТ1 обнаружены на клетках адвентиции сосудов сетчатки, что может означать, что мелатонин способен непрямым образом воздействовать на гладкие мышцы сосудистой стенки.

Рецептор МТ2 в основном экспрессируется в сетчатке и отделах промежуточного мозга. Его активация подавляет высвобождения NO и синтез цГМФ в клетках непигментного эпителия, продуцирующего водянистую влагу. Это свидетельстует о том, что мелатонин может участвовать в регуляции продукции водянистой влаги именно через рецепторы МТ2. У мышей, нокаутных по гену МТ2, с возрастом наблюдалось уменьшение числа клеток в наружном ядерном слое сетчатки.

Существует и третий тип мембранных молекул, имеющий сайт связывания с мелатонином – хинон-редуктаза II . Иногда его называют мелатониновым рецептором МТ3, что не совсем корректно, так как он не вызывает инициализации сигнальных путей. Его активность угнетается при повышении концентрации мелатонина. Селективный антагонист МТ3 5-карбоксикарбониламино-N-ацетилтриптамин вызывает снижение внутриглазного давления у кроликов. Локализация МТ3 пока не установлена, но предположительно они должны находиться в цилиарном теле и трабекулярной сети. Не вполне ясен механизм их действия на ВГД – действуют ли они на продукцию водянистой влаги или, наоборот, усиливают ее отток, либо влияют каким-то другим способом.

И МТ 1, и МТ2 рецепторы обнаружены в сетчатке – во внутреннем ядерном (горизонтальные и амакриновые клетки) слое, внутреннем плексиморфном слое, на ганглиозных клетках и пигментном эпителии. Кроме того, они присутствуют в цилиарном теле.

Ядерные рецепторы мелатонина принадлежат суперсемейству ретиноевой кислоты RZR/ROR. RORα (NR1F1) и RORβ (NR1F2) (ранее их относили к семейству ретиноидных/тиреоидных ядерных гормональных рецепторов). RORα имеет несколько изоформ, их работа связана с убиквитиновой активностью. Мелатонин ингибирует экспрессию RORα за счет модуляции Са²⁺-кальмодулиновой сигнальной системы, подавляющей активность транскрипционных и посттрансляционных факторов RORα. Зафиксировано участие Са²⁺-кальмодулин-зависимых протеинкиназ 2-го типа в этой системе. Рецептор RORβ обнаружен только в сетчатке, структурах головного и спинного мозга, с максимальным уровнем экспрессии в СХЯ гипоталамуса, pars tubularis (РТ) гипофиза, таламусе и эпифизе.

Связывание мелатонина с МТ1или МТ2 рецепторами через вторичные мессенджеры и каскады фосфорилирования активирует рецепторы RZR/ROR. Однако есть данные, что мелатонин осуществляет регуляцию ядерных рецепторов через кальций-кальмодулиновый сигнальный путь посредством изменения концентрации внутриклеточного кальция при связывании с МТ1/МТ2 либо напрямую связываясь с кальмодулином.

2.2 Свойства мелатонина

Использование классических генетических технологий привело к идентификации значительного числа генов, экспрессия которых изменяется под воздействием мелатонина. В нейронах сетчатки он стимулирует экспрессию 6 генов и ингибирует транскрипцию 8. В клетках пигментного эпителия сетчатки стимулирует экспрессию 15 генов и ингибирует транскрипцию 2 генов. В сердечной ткани были обнаружены 212 генов, экспрессия которых изменялась при действии мелатонина, из них экспрессия 146 генов усиливалась, а 66 – угнеталась.

2.3 Мелатонин и регуляция биологических ритмов

Под биологическими ритмами подразумевают периодически повторяющиеся через равные промежутки времени физиологические процессы, отличающиеся интенсивностью и сложностью вовлекаемых структур (периодически повторяющиеся изменения характера и интенсивности биологических процессов и явлений свойственны живой материи на всех уровнях ее организации – от молекулярных и субклеточных до биосферы). Ритмы, имеющие период 24-28 часов, называются циркадианными (циркадными). Роль эпифиза заключается в том, что он служит основным ритмоводителем функций организма, прежде всего с помощью гормона мелатонина, выполняющего роль фоторегулятора циркадианного ритма. Кроме эпифиза его синтез обнаружен в сетчатке, ЖКТ, сердце, тимусе, клетках иммунной системы, антральных фолликулах и половых железах. Синтез экстрапинеального мелатонина не имеет собственной периодичности и задается секрецией мелатонина в эпифизе. Мелатонин и дофамин являются антагонистами и работают как сигнальные молекулы дневной и ночной активности. В опыте на кроликах мелатонин ингибировал кальций-зависимое высвобождение дофамина клетками сетчатки.

2.4 Антиоксидантные свойства

Антиоксидантные свойства мелатонина изучали Stasica et al. авторы исследования считают, что гидроксильный радикал атакует С2 атом индольного кольца. Скавенджер алкоксильных радикалов. C перекисью реагирует в две фазы. Во время второй фазы образуется метаболит АФМК, который, как будет сказано далее, тоже обладает антиоксидантными свойствами. Взаимодействует с хлорноватистой кислотой, корую выделяют активированные нейтрофилы в очаге воспаления. При аутооксилении рибофлавина под действием света, мелатонин подавляет образование синглетного кислорода. В этой системе был обнаружен АФМК, однако путь его образования остается неизвестным. Позднее (Zang) были подтверждены свойства мелатонина как тушителя синглетного кислорода. В исследовании Roberts et al. было подтверждено, что мелатонин является скавенджером синглетного кислорода.

Как было сказано выше, значительную роль в патогенезе увеального воспаления играет окислительный и нитроксидный стресс. Остановимся подробнее на антиоксидантных свойствах мелатонина.

Мелатонин является основным скавенджером свободных радикалов как кислородного так и азотного происхождения в том числе пероксинитрита, а также карбонатного радикала CO₃ образующегося в присутствии физиологических количеств СО₂ , при чем проявляет свойства скавенджера и в физиологических, и в фармакологических концентрациях.

Не только мелатонин, но и некоторые из его метаболитов могут ингибировать свободные радикалы и их производные

Важная особенность, выделяющая его из ряда других антиоксидантов, - это отсутствие прооксидантных свойств. Все классические антиоксиданты в определенной концентрации становятся прооксидантами. Мелатонин же является только скавенджером свободных радикалов (по данным электрон-резонансной спектроскопии) и не участвует в окислительно-восстановительных реакциях. Из-за этого его относят к так называемым терминальным, или суицидальным антиоксидантам.

Существенное преимущество мелатонина перед классическими антиоксидантами заключается в том, что он не только взаимодействует со свободными радикалами, но и оказывает геномное воздействие – регулирует экспрессию генов антиоксидантных ферментов – СОД и глутатионпероксидазы – и стимулирует активность g-глутамилцистеинсинтазы, усиливая, таким образом, продукцию другого внутриклеточного антиоксиданта – глутатиона (GSH). Глутатион является наиболее важным тиолом небелковой природы в живых системах. При оксилении тиоловой группы образуется глутатиондисульфид (GSSG). Влияние на гены, возможно, осуществляется через эпигенетические механизмы. Кроме того, активность антиоксидантных ферментов, как и экспрессии их генов подчиняется циркадным ритмам, что позволяет предположить участие мелатонина в их регуляции. Молекулярный механизм этого влияния пока неясен. По данным Mayo он опосредован рецепторами МТ1/МТ2 и вторичным мессенджером цАМФ, фосфолипазой С и концентрацией внутриклеточного кальция. Кроме того, связывание мелатонина с мембранными рецепторами может стимулировать каскад МАР-киназы (Mitogen activated protein) и таким образом активировать ряд транскрипционных факторов. Интересно, что в опытах на культурах клеток экспрессия генов увеличивалась только при наномолярных концентрациях мелатонина (10^-9 М в среде), а при бóльших дозах эффект отсутствовал. Такие концентрации соответствуют уровню мелатонина в сыворотке крови во время ночного пика in vivo. В большинстве опытов на животных вводимые дозы мелатонина превышали этот уровень, однако положительный эффект все же наблюдался. Вероятно, в данном случае мелатонин действовал в большей степени как скавенджер свободных радикалов, снижал таким образом уровень окислительного стресса, на что клетки отвечали активацией экспрессии генов антиоксидантных ферментов. Впрочем, и в опытах на животных более низкие дозы часто оказывались более эффективными.

В норме мелатонин улавливает свободные радикалы, образующиеся в митохондриях, снижает утечку электронов из дыхательной цепи, поддерживая таким образом, синтез АТФ.

Мелатонин снижает проницаемость эндотелия, возрастающую под влиянием провоспалительного IL-1b, который играет важную роль в патогенезе развития и поддержания воспаления.

Проницаемость тканевого барьера зависит, в частности, от коллагеназы ММР-9, которая способна нарушать эндотелиальные межклеточные контакты, разрушая входящие в их состав белки VE-кадгерин и окклюдин. Мелатонин, снижая экспрессию MMP-9, препятствуя проникновению в ядро факктора NFkB, и усиливает экспрессию гена ингибитора TIMP-1, защищая, таким образом, эндотелиальный барьер.

Против нитроксидного стресса

Традиционные антиоксиданты не взаимодействуют с пероксинитритом. Поэтому их вклад в уменьшение воспаления ограничивается влиянием на окислительный стресс, в то время как на нитроксидный они могут воздействовать лишь косвенно, уменьшая количество О2-, но не имея возможности прямо нейтрализовать высокотоксичный пероксинитрит.

Мелатонин является мощным ингибитором экспрессии генов NOS-1 и NOS-2, уменьшая тем самым генерацию NO и пероксинитрита. Также он способен напрямую связывать NO с образованием стабильного продукта N-нитрозомелатонина.

Как было сказано выше, при повреждении ДНК пероксинитритом происходит сверхактивация фермента репарации PARP-1, который в процессе работы потребляет слишком много NAD⁺,что приводит к энергетическому дефициту клетки. Сохранение NAD⁺ и увеличение выработки клеточной энергии могут облегчить репарацию. Именно этим процессам способствует мелатонин, сохраняя клеточную выработку энергии и защищая поврежденную ДНК.

2.5 Влияние на внутриглазное давление

Местное применение мелатонина снижает ВГД у человека и крыс. Пинеалэктомия у цыплят не влияет на суточные колебания ВГД, по-видимому, их обеспечивает местный мелатонин, синтезируемый клетками непигментного эпителия.. Колебания содержания мелатонина в водянистой влаге и плазме крови совпадают, пик приходится на ночное время. Известно, что секреция влаги коррелирует с суточными изменениями ВГД, поэтому было высказано предположение, что мелатонин регулирует ВГД путем изменения секреции влаги. Мелатонин изменяет трансмембранный транспорт ионов в клетках тканей глаза в культуре, в частности, в клетках трабекулярной сети. Расслабление этих клеток должно вызвать увеличение оттока водянистой влаги. однако применение мелатонина перорально у здоровых людей снижало ВГД, но не влияло на отток водянистой влаги.

При системном применении мелатонин вызывает существенные изменения глубины передней камеры и витреальной полости, что может свидетельствовать о его участии в росте и формировании глаза.

2.6 В роговице

Митотическая активность клеток эпителия роговицы максимальна ночью и снижается днем. У крыс суточные колебания особенно выражены на периферии роговицы. Показано, что эти колебания влияют на заживление ран роговицы и на действие лекарственных препаратов на эпителий. Так как эти колебания сохраняются и после деструкции фоторецепторов, можно предположить, что задаются они не мелатонином из сетчатки. Скорее всего, их задает мелатонин, синтезируемый в непигментном эпителии цилиарного тела. На опыте с белыми кроликами было показано, что мелатонин в микромолярных количествах ускоряет заживление ран роговицы. Этот эффект ингибировал его антагонист лизиндол.

Кроме того, мелатонин опосредует суточные колебания содержания воды в роговице (in vitro). Считается, что у человека это определяет суточные изменения толщины роговицы. Рецепторы к мелатонину у человека есть на эпителии, эндотелии и кератоцитах.

2.7 В сетчатке

Мелатонин синтезируется фоторецепторами сетчатки, но в кровеносное русло не выходит, работая внутри глаза, а вот плазменный мелатонин проникает в глаз. кроме этого. Он синтезируется цилиарным эпителием и выделяется в водянистую влагу. Также есть сведения о том, что его способны синтезировать клетки хрусталика.

В сетчатке мелатонин действует как нейромодулятор, опосредующий темновую адаптацию и моторику сетчатки. Он ингибирует высвобождение дофамина и стимулирует выброс ГАМК. Дофамин подавляет синтез мелатонина фоторецепторами через рецепторы D2. Мелатонин подавляет ответ клеток горизонтального слоя сетчатки на активацию D1 рецепторов и потенцирует их активацию в ответ на глутамат, а также вызывает деполяризацию мембран Н1 горизонтальных клеток. У человека совпадают суточные ритмы ЭРГ и колебания уровня мелатонина.

Мюллеровы клетки играют большую роль в поддержании и регуляции проницаемости гематоретинального барьера, поскольку находятся в непосредственной близости от сосудов сетчатки. Антиглиальный кислый белок (GFAP) является маркером реактивных астроцитов, и его экспрессия значительно меняется при патологии сетчатки. Мюллеровы клетки в норме начинают экспрессировать его при патологии. В исследованиях Sande выявлено, что инъекция ЛПС вызывает повреждение мюллеровых клеток, сопровождающееся повышением уровня GFAP. Мелатонин же этому препятствует.

2.8 Производные мелатонина

В качестве антиоксидантов выступает не только сам мелатонин, но и его метаболиты, образующиеся в процессе взаимодействия с радикалами. Антиоксидантую активность проявляют циклический 3-гидроксимелатонин, N1-ацетил-N2-формил-5-метоксикинурамин (АФМК) и, возможно, другие. АФМК имеет собственные биологические функции сообщалось о том, что он. как и мелатонин взаимодействовать с рецепторами, а также ингибировать синтез простагландинов. Кроме того, его физические свойства предполагают антирадикальнцю активность. В эксперименте было показано, что АФМК значительно снижает перекисное окисление ДНК, причем эффект зависит от дозы. Липиды он защищал в меньшей степени, и, соответственно, в большей дозе(вероятно, потому что сам липофилен). В той же работе было показано, что он работает как скавенджер. Таким образом, АФМК является высокоэффективным низкомолекулярным антиоксидантом. Он вполне может выступать как эндогенный антиоксидант, функционирующий в составе естественной антиоксидантной системы организма. На культуре клеток гиппокампа было показано, что в нервной ткани защитный эффект АФМК даже выше, чем у мелатонина (неопубликованные данные авторов статьи).

2.9Протективные свойства

Применение мелатонина в дозе 1 мг в сутки снижало побочные эффекты дексаметазона у крысят, такие как уменьшение массы тела, атрофия тимуса и надпочечников (подтверждено гистологически), увеличение содержания в крови триглицеридов и свободных жирных кислот. Дексаметазон давали в дозе 0,01-0,04 мг в сутки. При более низких дозах дексаметазона защитный эффект был больше. На повышение в крови глюкозы и глутамат-пируват-трансаминазы под действием дексаметазона мелатонин не влиял. Позже было показано протективное действие мелатонина на молодых и на взрослых крысах, в краткосрочных и длительных опытах. Таким образом, защитное действие мелатонина не зависит ни от возраста, ни от продолжительности лечения кортикостероидами.

2.10 Применение мелатонина в офтальмологии

Современные методы лечения увеитов имеют ограниченную эффективность и большое количество побочных эффектов. В 2006-2008 годах Kukner и Sande изучали возможность применения мелатонина для лечения увеитов. В исследовании Kukner увеит у морских свинок индуцировали введением бычьего сывороточного альбумина в стекловидное тело. Мелатонин, витамин Е или апротинин вводили интраперитонеально в течение 3 суток после инъекции БСА. Все три вещества эффективно снижали отек сетчатки и содержание лептина в тканях глаза. Sande использовал модель эндотоксинового увеита, воспроизводимого путем интравитреального введения ЛПС золотистым хомячкам. Мелатонин в виде пеллет вводился подкожно за 2ч до инъекции, а также через 24ч и 8 суток после нее. Мелатонин снижал поступление белка и клеток в переднюю камеру, т.е. проницаемость ГОБ, активность NOS в сетчатке, содержание TNF-a и NFkB, равно как и выраженность клинических признаков и изменения ЭРГ. Результаты этих исследований показывают, что мелатонин уменьшает клинические, биохимические, гистологические, ультраструктурные и функциональные проявления увеита, вероятно, через NFkB-зависимый механизм.

При экспериментальном аутоиммунном увеите/пинеалите у крыс ночной (пиковый) уровень мелатонина в сыворотке крови был в 3 раза ниже, чем у здоровых. Дневные значения также были ниже. У пациентов с увеитами (болезнь Бехчета, саркоидоз, болезнь Вогт-Коянаги-Харада и др.) ночные значения концентрации мелатонина в сыворотке также были значительно ниже, чем у здоровых.

Подобные исследования проводились на пациентах с разными типами увеита: ирит, иридоциклит, хориоретинит, панувеит, и показали, что у всех пациентов уровень мелатонина в сыворотке был снижен.

В работе, в которй крыс иммунизировали S-антигеном, специфичным для сетчатки и эпифиза. У крыс развивались одновременно увеит и пинеалит. Есть вероятность, что то же происходит и у пациентов с увеитом.

В литературе есть данные об успешном применении мелатонина при фотокератите, катаракте, глаукоме, ретинопатии новорожденных и ишемии-реперфузии.

Мелатонин может также выступать в качестве нейпропротектора за счет способности взаимодействовать с кальмодулином и компонентами микротрубочек, блокировать повышение уровня внутриклеточного кальция, ингибировать синтез NO, снижать уровень VEGF, и концентрацию глутамата в синапсах сетчатки.

Было показано, что мелатонин ослабляет постишемическое повышение проницаемости ГЭБ после экспериментального ишемического инсульта у мышей, уменьшает отек мозга, также снижая проницаемость ГЭБ у крыс.

2.11 Противораковая активность

Снижение воспалительной инфильтрации и дистрофических изменений кишечного эпителия при болезни Крона. По сравнению со стандартным лечением, лечение с использованием мелатонина отмечалось достоверное уменьшение воспаления, нормализация клеточного состава и секреторной активности клеток.

В опытах на различных моделях у животных и человека индуцированного химического канцерогенеза было обнаружено, что применение мелатонина оказывает угнетающее влияние на возникновение и развитие опухолей молочной железы, шейки матки и влагалища, кожи, подкожной клетчатки, легких, эндометрия, печени, толстой кишки, что свидетельствует о значительной широте спектра противоракового эффекта мелатонина. Возможные механизмы ингибирующего воздействия мелатонина на канцерогенез молочной железы интенсивно изучается в последнее время.